Metoda na principu kompetitivní vazby na proteiny (competitive protein-binding assay CPBA) sleduje soutěž T3 ze séra a T3 značeného 125I o omezený počet vazebných míst na TBG. Protože je 99,7 % T3 vázáno na TBG
a jiné bílkoviny, je třeba zajistit, aby bylo konstantní množství TBG v každé zkumavce. Jódtyroniny se extrahovaly na katexové pryskyřici a T3 a T4 se dělily papírovou chromatografii.
Diskrepance mezi jednotlivými metodami pro T3 jsou větší než pro T4, což je dáno jednak tím, že se stanovuje nižší koncentrace, dále rozdílností v křížové reaktivitě u jednotlivých antisér, rozdílnými interferencemi bílkovin
a rozdílech v citlivosti metod.
RIA je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu. Značkou je 125I. Nejvíce se využívá separace na pevné fázi, kdy je protilátka vůči T3 vázaná na pevnou podložku jako jsou skleněné kuličky, plastové zkumavky, celulóza nebo magnetické částice. Lze také použít druhé protilátky anebo polyetylenglykolu k vysrážení imunokomplexu. Kompetitivní postup se provádí v přítomnosti blokačního činidla, které uvolňuje T3 z nosných proteinů. Rozsah metody je obvykle 0,31 – 9,22 nmol/l. Běžný detekční limit RIA je 0,11 nmol/l. Křížová reaktivita: L-tyroxin 0,5 %, D-tyroxin 1,1 %, trijódtyrooctová kyselina 19,8 %, tetrajódtyrooctová kyselina 0,44 %. Preciznost v sérii dosáhla CV 3,1 – 8,9 %, mezi sériemi 5,7 – 10,0 %. Odezva na ředění 85 – 100 %.
Heterogenní enzymová analýza: Vzorek nejprve reaguje s roztokem salicylátu, který uvolní vázaný T3. Ten se pak váže na konjugát protilátky vůči T3 s navázanou β-galaktosidázou. Zbytek konjugátu se následně váže na částice oxidu chromičitého potažené T3 a odstraní magnetickou separací. V supernatantu je původní imunokomplex s β-galaktosidázou, který se převede do reakční kyvety obsahující chlorfenolovou červeň
s navázaným β-d-galaktopyranosidem, který je enzymovým markerem rozštěpen na chlorfenolovou červeň, absorbující při 577 nm. Nárůst absorbance se sleduje bichromaticky (577 proti 700 nm) a je přímo úměrný koncentraci T3 ve vzorku. Rozsah metody je 0,3 – 9,2 nmol/l. Analytická citlivost metody je 0,3 nmol/l. Preciznost dosáhla v sérii CV 0,9 – 5,1 %, celkem 2,6 – 9,1 %. Žádná testovaná látka nezpůsobila interferenci > 10 %. Křížové reakce jsou zanedbatelné (nejvyšší D-tyroxin 0,44 %).
Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T3 je v kompetitivním uspořádání a obvykle používá jako značku křenovou peroxidázu. Mikrotitrační destičky jsou potaženy kozí protilátkou proti myšímu IgG. Přidá se myší monoklonální protilátka proti T3 a po konkurenční imunoreakci T3 ze séra a konjugátu T3 s POD se jamky vymyjí a přidá se substrát tetrametylbenzidin. Barevná reakce se zastaví 1M HCl a absorbance se měří při 450 nm vertikálním fotometrem. Absorbance je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku. Detekční limit metody je 0,31 nmol/l. Rozsah měření je do 15,4 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 3,2 – 9,6 %, mezi sériemi 1,4 – 10,3 %. Výtěžnost metody je 96 – 119 %. Odezva na ředění 94 – 109 %. Křížová reaktivita: trijód-D-tyronin 99,6 %, L-tyroxin 3,75 %, D-tyroxin 6,88 %, kyselina trijódtyrooctová 118,7 %, monojódtyrosin 3,92 %, dijódtyrosin 1,16 %.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) je technika, kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická vůči T3 je imobilizována na mikročásticích. Jako marker slouží T3 značený ALP. T3 ze vzorku a konjugát ALP-T3 se nechají postupně reagovat s imobilizovanou protilátkou. Po inkubaci se provede promytí na fritě roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem vymyje volný T3 z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence (excitace 485, emise 525 – 550 nm) je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku a je měřena fluorimetrem. Detekční limit metody je 0,46 nmol/l. Rozsah měření je do 12,3 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 1,8 – 8,9%, celkem 2,8 – 12,2 %.
Fluorescence rozložená v čase (DELFIA) je heterogenní kompetitivní postup s použití chelátů europia jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce probíhá v mikrotitračních destičkách. Kyselina 8-anilino-1-naftalensulfonová a salicylát slouží k uvolnění T3 z vazebných proteinů. Imunokomplex
s monoklonální myší protilátkou vůči T3 je pak zachycen pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny jamek. Po promytí jsou ionty europia disociovány z vázané fáze a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná množství T3 ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,5 – 4,0 %, mezi sériemi 5,2 – 7,2 %; výtěžnost 94 – 107 %. Analytická citlivost metody (±2 SD) je 0,3 nmol/l. Rozsah měření do 10 nmol/l. Křížová reaktivita při 50 % zastoupení: D-tyroxin 56 %, kyselina 3,3´,5-trijódthyrooctová
103 %, 3,5- dijód-L-tyronin 0,86 %, reverzní T3 0,35 %, T4 0,20 %.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je v kompetitivním uspořádání. T3 ze vzorku soutěží s T3 navázaným na paramagnetické částice o omezený počet vazebných míst na monoklonální myší protilátce označené esterem akridinu. Po krátké inkubaci jsou paramagnetické částice odděleny
v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka s esterem akridinu. Pak jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a emisi luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku. Metoda je použitelná bez ředění do 12,3 nmol/l. Mez detekce (±2 SD) je 0,15 nmol/l; výtěžnost 88,3 – 102,2 %. Odezva po ředění 96,1 – 114,2 %. Preciznost v sérii CV 3,5 – 6,2 %, mezi sériemi 4,4 – 7,1 %, celkem 5,6 – 9,4 %.
D-tyroxin se vykazuje interferenci 0,57 %, L-tyroxin 0,24 %, D-trijódtyronin 100 %.
Jako značku lze použít také POD. Mikrotitrační destičky jsou potaženy oslí protilátkou vůči ovčí protilátce. Na ní se ukotví ovčí protilátka vůči T3. Proběhne kompetice T3 ze vzorku a T3 značeného POD o vazebná místa na ovčí protilátce. Po vymytí nenavázané frakce se přidá signální činidlo (luminol) s peroxidem vodíku a sleduje se luminiscence, která je nepřímo úměrná množství T3 ve vzorku. Rozsah metody je 0,2 – 13 nmol/l. Analytická citlivost je 0,1 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 3,22 – 5,22 %, celkem 4,74 – 9,12 %. Odezva na ředění
91 – 109 %, výtěžnost 86 – 110 %.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je navázána myší monoklonální protilátka proti lidskému T3. Kulička se inkubuje 30 minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným T3, kdy dochází ke konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření 477 nm, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 0,61 – 9,2 nmol/l. Analytická citlivost 0,29 nmol/l. Preciznost v sérii 4,4 – 12,0 %, celkově 5,3 – 15,0 %; odezva na ředění 83 – 114 %, výtěžnost: 99 - 104 %.
Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje po imunoreakci na kompetitivním principu, kdy se vzorek inkubuje s biotinem značeným T3 a soutěží o specifickou protilátku, značenou ruthéniovým komplexem
a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se při 620 nm měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,3 – 10 nmol/l. Detekční limit je 0,3 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 5,3 %, mezi sériemi 3,4 – 5,4 %.
Izotopová diluce s GC/MS byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T3 v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní standard 13C9-T3. Před analýzou se provede odbílkování vzorek, extrakce
a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována přídavkem 13C6-T4. T3 a 13C9-T3 byly přeměněny na N,O-diheptafluorbutyrylmetylesterové deriváty a monitorovány při m/z 844 a 853. Při metodě neinterferují reverzní T3 a T4. Rozsah metody 0,92 – 11,2 nmol/l. Detekční limit byl 100 pg. Výtěžnost 98,5 – 101,5 %. Preciznost dosahuje CV 0,8 – 1,5 %.
Izotopová diluce s LC/MS/MS elektrosprejí byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T3
v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní standard 13C9-T3. Před analýzou se provede odbílkování vzorek, extrakce a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována přídavkem 13C6-T4. Byly sledovány přechody m/z 652→606 pro T3 a 661→ 614 pro 13C9-T3. Při metodě neinterferují reverzní T3 a T4. Rozsah metody 0,92 – 11,2 nmol/l. Detekční limit byl 18 pg. Výtěžnost 98,5 – 102,7 %. Preciznost dosahuje CV 0,9 – 1,2 %.
Certifikovaný referenční materiál pro T3 nese označení IRMM-469 (Institute for Reference Materials and Measurements) obsahoval 3,3´,5-trijódtyronin o čistotě 97,1 % s rozšířenou nejistotou 0,7 %.
Analytické požadavky (CLIA-88): Pro diagnostické účely je vychýlení ±5,7 %, preciznost CV 11,5 %; pro terapeutické účely vychýlení ±2,6 %, preciznost CV 5,2 %.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Koncentrace T3 je v séru snížena: androgeny, citronan, deficit jódu, dexamethason, glukokortikoidy, hladovění, kyselina fenyloctová, kouření, lithium, malnutrice, močovina, peritoneální dialýza, plazmaferéza, prednison, stáří, stres, aj.
Koncentrace T3 je v séru zvýšena: cvičení, erytropoetin, hemodialýza, heroin, heterofilní protilátky, kyselina trijódthyrooctová, okluze žíly, propylthiouracil, prostaglandiny, proteiny (< 45 g/l), sezónní vliv (září – únor), těhotenství, aj.
