folát, vitamin B_c, vitamin B₉, vitamin M, folacin, pteroyl-L-glutamová kyselina, pteroyl-L-monoglutamová kyselina, pteroyl-L-glutamát; folate, folic acid; acidum folicum

Používá se venosní srážlivá krev odebrána nalačno (1 ml do 10 mg kyseliny askorbové). Lze odebírat i do heparinu nebo EDTA při stanovení v erytrocytech. Krev je třeba chránit před světlem a vyloučit hemolýzu. Doporučeno je dvojí stanovení v různé dny. Krev bez stabilizace je stálá 30 min, stabilizovaná 6 h. Sérum (plazma) je stálé ve tmě 24 h při 15 – 25 °C, (4 h) 1 – 7 d při 4 – 8 °C, alespoň 2 měsíce při -20 °C. Pokud se stanovení provádí v erytrocytech, obvykle se používá lyzační činidlo obsahující kyselinu askorbovou a guanidinhydrochlorid nebo jen samotnou kyselinu askorbovou.

Mikrobiologické metody jsou považované za referenční pro stanovení biologicky aktivního folátu. Používá se Lactobacillus casei, Streptococcus faecalis nebo Pediococcus cerevisiae, které pro svůj růst potřebují folát (linearita metody do 68,2 nmol/l). Bohužel všechny tyto organismy jsou velmi citlivé na antibiotika i jiné léky, např. metotrexát v séru. Navíc se vyžaduje alespoň 24 h pro růst mikroorganismů (resp. 16 – 18 h při 37 °C).

RIA může stanovovat současně folát i B₁₂. Jako vazebná bílkovina se používá β-laktoglobulin (FBP) a v kompetitivní reakci konjugáty ¹²⁵I-folát a ⁵⁷Co-B₁₂. Analýza probíhá v roztoku obsahujícím ditiotreitol a KCN. Folát se uvolní z endogenních proteinů varem; v případě erytrocytů této operaci předchází jejich lýza (90 min) kyselinou askorbovou. Pak se přidává prasečí vnitřní faktor B₁₂ a FBP a konjugáty ¹²⁵I-folát a ⁵⁷Co-B₁₂. Proběhne inkubace 1 h za laboratorní teploty a následně centrifugace a dekantace. Imunokomplex zůstává na dně zkumavky ve formě sraženiny. Měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci folátu ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 4,5 – 45,3 nmol/l. Analytická citlivost je 4,5 nmol/l (některých soupravách až 1,1 nmol/l). Preciznost celkem 3,2 – 6,3 % (v sérii u různých RIA souprav 1,6 – 22,4 %).

K dispozici jsou také soupravy pouze pro stanovení folátu a to jak s ¹²⁵I, tak ³H markery.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá zakotvený folát a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a monoklonální myší protilátka vůči folátu. Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá protilátka vůči myšímu IgG značená POD. Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 20 min (třepání), pak se pipetuje stop činidlo (0,5 M H₂SO₄). Absorbance při 450/620 nm se měří do 30 min a je nepřímo úměrná koncentraci kyseliny listové ve vzorku.  Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 4,5 – 906 nmol/l. Preciznost v sérii je 3 %, zpětný výtěžek 90 – 110 %. Křížová reaktivita: kyselina dihydrolistová 18 %, kyselina tetrahydrolistová 5 %.

FIA založená na technologii záchytu iontů. Při používání této technologie se na skleněná vlákna reakční matrice nadávkuje kvartérní amonná sloučenina o vysoké molekulové hmotnosti – roztok pro záchyt iontů. Tento roztok vnáší na matrici kladný náboj, který umožňuje zachytit komplexy analytu se záporným nábojem. Během vyšetření vznikají polyanionové záporně nabité komplexy analytu. Tyto komplexy jsou zachycovány elektrostatickou interakci s kladně nabitou reakční matricí. Metoda využívá rozpustnou afinitní reagencii. Tato reagencie je složena z proteinu vázajícího folát (FBP - Folate Binding Protein) spojeného na základě afinity s monoklonálními protilátkami, které jsou kovalentně navázány na karboxymetylamylózu (polyanion). Při vyšetření se během vazebné reakce mezi folátem a rozpustnou afinitní reagencii vytvářejí komplexy analytu se záporným nábojem. Vzniklé komplexy analytu se záporným nábojem jsou zachycovány elektrostatickou interakcí s kladně nabitou reakční matricí. Kvantifikace folátu se provede změřením počtu neobsazených míst na FBP navázaném na matrici za použití konjugátu kyseliny pteroové (analog folátu) s alkalickou fosfatázou (molekula vytvářející signál) a substrátu 4-metylumbeliferylfosfátu. Ten se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky (signál je nepřímo úměrný koncentraci folátu). Šestibodová kalibrace je v rozsahu 2 – 45,3 nmol/l. Vzorky s koncentrací folátu > 45,3 nmol/l se ředí manuálně 2x (do 90,6 nmol/l) nebo 4x (do 181,2 nmol/l), a koncentrace po ředění musí být > 2 nmol/l. Preciznost v sérii je 1,7 – 14,8 %, celková preciznost metody je 2,2 – 16,3 %; zpětný výtěžek 86,7 – 109,3 %, linearita ředění 90,0 – 154,1 %. Senzitivita je 2 nmol/l (2 SD nulového blanku). Metotrexát, aminopterin a kyselina folinová (leukovorin) jsou chemoterapeutika, jejichž molekulární struktura je podobné folátu. Tato agens v metodách na stanovení folátu nepatrně zkříženě reaguji (nejvíce kyselina folinová < 3 %) s proteinem vázajícím folát. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Ani vysoké koncentrace bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (22,6 mmol/l) neruší.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Mikrotitrační destičky jsou potaženy streptavidinem. Po pipetování vzorku se přidá biotinylovaná protilátka vůči folátu a folát značený Eu³⁺. Po inkubaci (2 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí 6x, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 15 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm) je nepřímo úměrná koncentraci folátu ve vzorku a měří se do 1 h. Preciznost mezi sériemi je 3,4 % (plazma), resp. 6,5 % (erytrocyty).

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání začíná uvolněním folátu z endogenních proteinů ditiotreitolem a následně roztokem KOH. Upravený vzorek se přenese do další zkumavky a přidá se protein vázající folát, zakotvený na paramagnetických částicích a borátový pufr. Po inkubaci se přidá konjugát folátu s akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině folátu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 3,4 – 45,3 nmol/l (Vzorky s hodnotami folátu > 45,3 nmol/l lze automaticky 2x nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být hodnota > 82,8 nmol/l). Preciznost v sérii je 1,4 – 5,4 %, celkově 3,1 – 6,4 %. Mez detekce 1,1 nmol/l, mez stanovitelnosti 3,4 nmol/l. Ani vysoké koncentrace bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší. Metotrexát, aminopterin a kyselina folinová (leukovorin) jsou chemoterapeutika, jejichž molekulární struktura je podobné folátu. Tato agens v metodách na stanovení folátu nepatrně zkříženě reaguji (nejvíce metotrexát 2,1 %) s proteinem vázajícím folát. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Vzorek se inkubuje s ditiotreitolem 4,7 min při 37 °C. Přidá se biotinylovaný FBP a paramagnetické latexové částice potažené avidinem. Směs se inkubuje 6,3 min při 37 °C. Přidá se folát značený esterem akridinu a inkubuje 3 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Rozsah kalibrace na základě dvou standardů je 0,79 – 54,36 nmol/l. Luminiscence záblesku je nepřímo úměrná koncentraci folátu. Vzorky s koncentrací folátu > 54 nmol/l se ředí diluentem automaticky 2x nebo manuálně dle potřeby (po automatickém ředění) ještě 2x. Analytická citlivost je 0,79 nmol/l. Preciznost v sérii 3,7 – 5,9 %, mezi sériemi 7,1 – 15,2 %. Linearita ředění je 91,7 – 116,6 %, zpětný výtěžek 81,5 – 115,3 %. Triacylglyceroly (22,6 mmol/l) a bilirubin (342 µmol/l) neruší.

Jiné stanovení CLIA je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Folát (ze séra, heparinizované plazmy, nebo erytrocytů po lýze kyselinou askorbovou) je uvolněn z endogenních proteinů ditiotreitolem v prostředí pufrovaného roztoku kde he dávkován také folát značený ligandem (inkubace 30 min, 37 °C). Pak se přidá roztok NaOH + KCN (inkubace 30 min, 37 °C). Upravený vzorek se pipetuje do další zkumavky, kde dochází ke kompetici o vazebná místa na FBP, který je vázaný na monoklonální myší protilátku vůči FBP imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá anti-ligand s ALP a inkubuje se 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci kyseliny listové ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah měření je 23 – 54 nmol/l. Všechny vzorky, jejichž koncentrace by mohla být mimo kalibrační rozmezí, je třeba naředit diluentem. Analytická citlivost 1,8 nmol/l. Preciznost v sérii 2,4 – 6,9 %, mezi sériemi 5,2 % – 8,8 %; linearita ředění 101 – 114 %, zpětný výtěžek 96 – 106 %. Hemoglobin, bilirubin (342 µmol/l) a triacylglyceroly (56,5 mmol/l) neruší. Folát vazebný protein použitý v reagencii vykazuje v jisté míře zkříženou reaktivitu s metotrexátem. Protože vysoké dávky metotrexátu infúzí mohou mít za následek hladiny v cirkulaci 102000 nmol/l po aplikaci a řádově 4500 nmol/l za 48 hodin, souprava pro stanovení kyseliny listové se nemá používat u pacientů, kteří současně dostávají tento lék. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. EDTA plazma se pro stanovení nedoporučuje.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek (nebo hemolyzát) obsahující folát (uvolněný z endogenních vazebných proteinů), bílkovina vázající folát, myší monoklonální protilátky vůči tomuto vazebnému proteinu, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG a konjugát folátu s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství folátu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 1,1 – 45,3 nmol/l. (po ředění 2x nulovým kalibrátorem do 90,6 nmol/l). Analytická citlivost 1,1 nmol/l. Preciznost v sérii 2,29 – 4,55 %, celkově 3,33 – 5,28 %; linearita ředění je 96 – 127 %. Křížová reaktivita do 0,2 %. Neruší bilirubin 171 µmol/l a triacylglyceroly 20,3 mmol/l. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v kompetitivním uspořádání je založena na technologii LOCI. Stanovení se provádí v síru nebo heparinizované plazmě. Reagencie LOCI zahrnují dvě syntetické částicové reagencie a značený protein vážící folát (FBP). První částicová reagencie (Chemibeads) je potažena derivátem kyseliny listové a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá částicová reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzitivní barvivo. Dříve, než je spuštěna imunologická část reakce, je pacientský vzorek předběžně zpracován NaOH a ditioerytritolem (DTE) za účelem uvolnění sérového folátu z endogenního proteinu a uchování 5-metyltetrahydrofolátu v redukované formě. Po předběžném zpracování vzorků jsou postupně přidány do reakční nádobky reagencie Chemibeads a značená reagencie vážící folát. Folát z pacientského vzorku soutěží s folátem na Chemibeads o omezené množství vazebných míst značeného (biotinylovanou myší monoklonální protilátkou) FBP. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotinylovanou část značeného FBP a vytvoří částicové párové imunokomplexy. Iluminací komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencií Sensibeads uvolní singletový kyslík, který difunduje do reagencií Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál se měří při vlnové délce 612 nm a představuje inverzní funkci koncentrace folátu ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 1,1 – 45,3 nmol/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 5x). Analytická citlivost je 1,1 nmol/l. Preciznost v sérii 3,9 – 6,0 %, mezi sériemi 5,0 – 8,4 %. Zpětný výtěžek 92,3 – 112,1 %. Triacylglyceroly 33,9 mmol/l a bilirubin 342 µmol/l neruší. Při stanovení výrazně interferuje metotrexát a leukovorin; dále cimetidin 47 % a chlorpromazin 16 %.

Jiná chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení je, když folát ze vzorku (folát z endogenních proteinů se předtím uvolní alkalickou denaturací a stabilizuje neutralizací; v případě erytrocytů nutno provést navíc lýzu kyselinou askorbovou) soutěží s folátem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst na biotinylovaném FBP. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Analýza trvá celkem 73 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě tříbodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci kyseliny listové ve vzorku. Rozsah měření 1,4 – 34 nmol/l. Analytická senzitivita 0,86 nmol/l, funkční senzitivita 1,4 nmol/l. Preciznost v sérii 2,2 – 5,6 %, mezi sériemi je 3,9 – 9,8 %. Hemoglobin interferuje při vyšetření. Bilirubin 205 µmol/l a triacylglyceroly 33,9 mmol/l nevadí. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání.

ECLIA Plná krev s antikoagulantem (heparin nebo EDTA) je smíchaná s roztokem kyseliny askorbové a inkubována přibližně 90 minut při 20 – 25 °C. Během té doby dojde k lyze erytrocytů, uvolnění a stabilizování intracelulárních folátů. Výsledný vzorek hemolyzátu je poté použit pro následné měření, nebo se může použít vzorek séra či plazmy bez předešlé úpravy. Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou v kompetitivním uspořádání trvá 27 min. Vzorek (25 µl) se inkubuje s 2-merkaptoetansulfonátem sodným a roztokem NaOH (folát se uvolní z endogenních vazeb na proteiny). Pak se přidá FBP značený ruthéniovým komplexem a následuje druhá inkubace. Poté se pipetuje biotinylovaný folát a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem; imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci folátu ve vzorku. Triacylglyceroly (17 mmol/l), bilirubin (564 µmol/l) a RF (< 1000 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 1,45 – 45,4 nmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí manuálně 2x (rozsah do 90,8 nmol/l). Analytická citlivost 1,45 nmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 4,54 nmol/l. Preciznost v sérii CV 2,4 – 5,8 %, mezi sériemi 3,4 – 9,4 %. Nedoporučuje se měřit vzorky u pacientů, kteří podstupují léčení přípravky jako metotrexát nebo leukovorin, nebo
e dochází ke křížové reakci vazebných proteinů folátů s těmito sloučeninami, ostatní preparáty mají křížovou reakci do 2,7 %. Ruší velmi vysoké hodnoty celkové bílkoviny a protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.

HPLC Vzorek plazmy se smísí s roztokem tetraboritanu draselného a askorbátu sodného; jako vnitřní standard se přidá etyltetrahydrofolát. Směs se zahřívá 30 min k varu za míchání a pak nechá stát přes noc při 4 °C. Před analýzou se roztok přefiltruje. Jestliže se provádí stanovení v erytrocytech, tak úpravě ještě předchází extrakce s roztokem Triton X-100. Jako mobilní fáze v afinitní chromatografii se používá 0,05 M fosforečnan draselný pH 7,0 s 5 % acetonitrilu (průtok 0,35 ml/min). Náplní kolony 4,6x250 mm byl fenylbentasil. Čtyřkanálový elektrochemický detektor používal napětí 0, 300, 500 a 600 mV. Pro vyčistění cely 700 mV. Detekční limit metody byl 0,21 nmol/l folátu. Preciznost v sérii 3,2 %, mezidenní 5,9 %; zpětný výtěžek 93,7 – 104,1 %. Analýza jednoho vzorku trvá 75 min a za 24 h lze analyzovat 47 vzorků.

ID-LC-MS/MS Izotopová diluce s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií používá jako vnitřní standard 5 uhlíků ¹³C na kyselině glutamové folátu. Pro detekci folátu se používá přechod m/z 442 → 295. Pro kalibraci byly použity kalibrátory 1,1 – 56,7 nmol/l (vnitřní standard 5,7 nmol/l). Rozsah měření 0,22 – 220 nmol/l folátu. Pro extrakci vzorku byl použit roztok mravenčanu amonného a kyseliny askorbové. Chromatografie probíhala na koloně 150x3 mm na pevné fázi Phenomenex (zrno 5 µm) a mobilní izokratické fázi metanol-acetonitril-kyselina octová (400+100+10) s průtokem 0,25 ml/min při 30 °C. Hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem používal turbo elektrosprej s pozitivní ionizací. Preciznost v sérii 3 – 13 %, mezi sériemi 10 – 20 %. Zpětný výtěžek pro folát byl 72,3 – 83,1 %.

Mezinárodní standard pro folát a vitamin B₁₂ ze 4. 4. 2008 nese označení WHO International Standard NIBSC 03/178.

Toleranční limit EHK: 27 %.

Snížení hodnot: amyloidóza, hemolytická anémie, hemodialýza, anorexie, celiakie, dermatitis herpetiformis, gastrektomie, hypertyreóza, Crohnova nemoc, psoriáza, sprue, těhotenství, alkoholismus, inhibitory aktivované teplem ve fazolích nebo hrášku, expozice vzorku na světle, malnutrice, poruchy absorpce, kuřáci, věk > 80 let, opakované rozmrazení séra; léky: aminopterin, ampicilin, antacida, antagonisté H₂ receptorů, antagonisté kyseliny listové, antikonvulziva, antimalarika, barbituráty, biseptol, cykloserin, daraprim, erytromycin, estrogeny, fenytoin, chloramfenikol, izoniazid, karbamazepin, kyselina acetylsalicylová, kyselina aminosalicylová, kyselina valproová, orální kontraceptiva, metotrexát, nitrofurantoin, penicilin, pentamidin, primidon, pyremetamin, rhytmochin II, septrin, spasmoveralgin, sulfasalazin, sumetrolin, supristol, tetracykliny, triamteren, trimetoprim, trimopan.

Zvýšení hodnot: hemolýza, hypertermie, vegetariáni, deficit vitaminu B₁₂; léky: fenformin, leukovorin, metformin.