bile acids

Odebírá se venosní srážlivá krev ráno nalačno (lačnění alespoň 8 h, jinde uvedeno jen 2 h). Doprava krve při 2 – 8 °C. U novorozenců odběr metodikou suché kapky. V moči z jednorázového vzorku spolu se stanovením kreatininu. Stabilita v séru za laboratorní teploty 7 d, při 4 – 8 °C 14 d, při -20 °C 6 měsíců.

Fotometrie Žlučové kyseliny ze séra (cholová, chenodeoxycholová, deoxycholová, lithocholová) jsou oxidovány (4 – 5 min při 37 °C)v pufru TRIS na 3-oxokyseliny za katalýzy 3α-hydroxysteroid dehydrogenázy. Při této oxidační reakci je nikotinamidadenindinukleotid (NAD⁺) redukován na NADH. Vzniklý NADH je v dalším kroku oxidován nitrotetrazoliovou modří na NAD⁺. Reakce je katalyzována diaforázou. Nitrotetrazoliová modř se redukuje na formazan, který je měřen (po 5 min a do 1 h po zastavení reakce stop činidlem, tj. 0,1 M HCl nebo H₃PO₄) při 530 nm nebo 540 nm. Intenzita zabarvení formazanu je přímo úměrná množství žlučových kyselin v séru. Rozsah měření je v intervalu 1 – 200 µmol/l. Reakci lze provádět i bez stop činidla a absorbanci sérového blanku měřit ihned po přidání 3α-hydroxysteroid dehydrogenázy a pak výsledek enzymové reakce přesně po 5 min. Senzitivita metody je 1 µmol/l. Preciznost v sérii je 1,2 – 7,7 %, mezi sériemi 1,9 – 8,3 %.

Citlivější postup (přibližně 5x) je cyklická reakce využívající thio-NADH. Signál je zesílen cyklickou regenerací reakce. Molekuly žlučových kyselin jsou opakovaně oxidovány a redukovány 3a-hydroxysteroid dehydrogenázou, přičemž oxidace probíhá na úkor redukce thio-NAD⁺ na thio-NADH, a redukce probíhá na účet oxidace NADH na NAD⁺. Při analýze se měří rychlost akumulace thio-NADH při 405 nm. Interference hemoglobinu 8 g/l a triacylglycerolů 13,5 mmol/l jsou < 10 %.

Fluorimetrie sleduje redukci NAD⁺ na NADH při oxidační reakci 3α-hydroxysteroid dehydrogenázy s 12 žlučovými kyselinami. Reakce probíhá za třepání 20 min ve tmě. NADH intenzivně fluoreskuje (excitace 530 nm, emise 585 nm) a signál je přímo úměrný koncentraci stanovovaných žlučových kyselin v séru nebo moči. Rozsah měření 1 – 150 µmol/l (vyšší koncentrace se měří po ředění vzorku destilovanou vodou).

RIA je založena na kompetici žlučových kyselin ze vzorku s glykocholovou kyselinou značenou ¹²⁵I o omezený počet vazebných míst na králičí protilátce zakotvené na stěnách zkumavky (37 °C, 1 h). Po vypláchnutí se měří gama-počítačem signál 0,5 – 2 min a je nepřímo úměrný koncentraci žlučových kyselin ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 50 µmol/l. Citlivost metody je 0,2 mol/l. Preciznost v sérii 14 – 18 %, mezi sériemi 7 – 12 %; zpětný výtěžek 84,2 – 100 %. Stejné principy byly popsány i v jiných soupravách, ale jako konjugáty byly použity: ¹²⁵I-cholylglycin, kyselina glykochenodeoxycholová značená ¹²⁵I; kyselina glykocholová a glykochenodeoxycholová značené ³H (detekce beta-počítačem).

GC-MS nedovoluje používat heparinizovanou plazmu ani hemolytické vzorky. Žlučové kyseliny ve fosfátovém pufru se extrahují na separačních kolonkách C18, eluují do metanolu a odpaří pod dusíkem při 60 °C. Po alkalické hydrolýze odparků konjugátů 10 % KOH (99 min při 140 °C v autoklávu) se hydrolyzát ochladí, okyselí 10 M HCl a přidá se fosfátový pufr. Hydrolyzované volné žlučové kyseliny ve fosfátovém pufru se extrahují na separačních kolonkách C18, eluují do metanolu a odpaří pod dusíkem při 60 °C. Odparek se derivatizuje 20 min za laboratorní teploty na metylestery éterickým roztokem diazometanu a odpaří pod dusíkem při laboratorní teplotě. Poté se odparek silanizuje 30 min při 60 °C trimetylchlorsilanem na trimetylsilylétery, odpaří pod dusíkem a rozpustí v n-hexanu. Směs se dělí za použití plynové chromatografie na skleněné kapilární koloně s 5% fenylmetylpolysiloxanem (15 m x 0,25 mm; velikost zrna 0,25 µm, gradient 160 – 310°C, průtok 1 ml/min), nosný plyn helium, doba analýze 18 min. Detekce se provádí pomocí hmotnostní spektrometrie. Jako vnitřní standard se používá kyselina 23,24-bisnor-3β-OH-5α-cholová m/z 419,3. Stanovené žlučové kyseliny: cholová m/z 368,3, chenodeoxycholová a ursodeoxycholová m/z 370,3,  lithocholová m/z 372,3, deoxycholová m/z 255,3. Zastoupení se udává v %. Méně dokonalý postup je použití plameno-ionizačního detektoru po separaci plynovou chromatografií.

HPLC se prováděla na koloně (250x4,6 mm, velikost zrna 5 µm) C18 s reverzní fází a mobilní fází (octan sodný 0,5 mol/l nastavený na pH 4,3 kyselinou fosforečnou) s průtokem 1 ml/min a při UV detekci 205 nm. Rozsah detekce jednotlivých žlučových kyselin byl 0 – 10 mmol/l, doba analýzy 20 min. Citlivost metody není dostatečná. Mnohem lepší je použití fluorescenčního detektoru (excitace 300 nm, emise 460 nm). Jako fluorescenční značku lze použít dansylhydrazin nebo k derivatizaci použít 2-bromacetyl-6-metoxynaftalen. Separační schopnost kolony se významně vylepší po imobilizaci 3α-hydroxysteroid dehydrogenázy.

LC-MS/MS používá extrakci žlučových kyselin na reverzní fázi C18 a simultánní sledování molekulárních i dceřiných iontů. Analýza trvá pouze 5 min a rozmezí detekce je 1 – 100 ng. Jako vnitřní standardy byly použité kyseliny 5-β-cholanová a 3,12-diol-7-on-5-β-cholanová. Zpětný výtěžek je 71,7 – 95,9 %. Vzorek byl upraven předběžnou extrakcí na kolonce C18 směsí chloroform-metanol 2:1. Po promytí vodou a n-hexanem byly žlučové kyseliny eluovány metanolem a rozpouštědlo odpařeno pod dusíkem. Odparek byl rozpuštěn v roztoku acetonitril-voda 1:1 (mobilní fáze má stejné složení) a nastřikován do kolony s následnou detekcí tandemovou hmotnostní spektrometrií s elektrosprejí. Molekulární a dceřiné ionty pro tri-, di- a monohydroxylované žlučové kyseliny konjugované s glycinem byly: m/z 464,4 a 74, m/z 448,6 a 74, m/z 432,6 a 74; pro tri-, di- a monohydroxylované žlučové kyseliny konjugované s taurinem m/z 514,6 a 124, m/z 482,6 a 124, m/z 482,6 a 124; pro vnitřní standard kyselinu 3,12-diol-7-on-5-β-cholanovou m/z 405,6 a 123. Jako mobilní fázi lze použít také gradient metanolu ve vodě 50 – 75 %. Tímto způsobem lze rozlišit až 18 různých žlučových kyselin.

Hodnoty snižuje: zrychlená střevní pasáž, porucha střevní resorpce; léky: cholestyramin.

Hodnoty zvyšuje: portální hypertenze (s kolaterálním oběhem), chronická aktivní hepatitida, jaterní cirhóza, intrahepatální nebo extrahepatální cholestáza, odběr po jídle; léky: cyklosporin, izoniazid, metotrexát, rifampicin.