fosforečnany anorganické

Starší název anorganický fosfor je vlastně nonsens, protože nestanovujeme tento nekov, ale směs hydrogenfosfátů a dihydrogenfosfátů. Vedle názvů hydrogenfosforečnan a dihydrogenfosforečnan se méně často používá hydrofosforečnan a dihydrofosforečnan (poslední dvojice je ale uvedena v ČSN).

Pro stanovení v plazmě je možné použít heparin lithný nebo sodný. Oxalát, citrát nebo EDTA se nesmí použít jako antikoagulancia. Fosfáty vykazují významný denní rytmus, doporučená doba odběru na stanovení v séru nebo plazmě je ráno nalačno. Hodnoty anorganických fosfátů v séru jsou nejvyšší u novorozenců a s věkem se snižují.
Po odběru krve do skleněné nebo plastové zkumavky je nutná bezprostřední separace korpuskulární fáze, jinak jsou výsledky falešně vyšší. Stabilita je pak 4 dny při +20 až + 25 °C, 7 dnů při +4 až +8 °C a 1 rok při -20 °C,
-70 °C 5 let. Pro stanovení v moči je nutná acidifikace na pH 1,0 - 2,0 pomocí 6 mol/l HCl, aby nedošlo
k vysrážení fosforečnanů. Stabilita acidifikovaných vzorků je 2 dny při +20 až +25 °C, 3 dny při +4 až + 8 °C
a 12 týdnů při -20 °C.
Silná hemolýza při stanovení ruší.

Spektrofotometrie: využívá se řady postupů, ale metody lze rozdělit do čtyř skupin: vznik molybdátofosforečné kyseliny (přímo, nebo po redukci na molybdenovou modř), vznik kyseliny vanadátomolybdátofosforečné, tvorba komplexu kyseliny molybdátofosforečné s bazickými barvivy, např. rodaminem B a konečně enzymové reakce. Stanovení vyžadující deproteinaci vzorku (např. kyselinou trichloroctovou v prostředí 1 mol/l H₂SO₄ nebo HNO₃) jsou opuštěny v praxi klinické biochemie. Základem současných metod je Fiske-Subarrowův postup, kdy fosfáty reagují s molybdenanem amonným za tvorby fosfomolybdenanu amonného. Vzniklý komplex se může měřit přímo při 340 nm, nebo po redukci na molybdenovou modř při 600 – 700 nm. Jako redukovadla lze použít SnCl₂ samotný nebo v kombinaci s hydrazinem, dále hydrochinon, fenylhydrazin, p-semidin (N-fenyl-
p-fenylendiamin), FeSO₄, kyselinu askorbovou, metyl-4-aminofenylsulfát, aminonaftylsulfonovou kyselinu (nevýhoda – snadno precipituje) a další. FeSO₄ a kyselina askorbová jsou jemná redukovadla, která neštěpí vazby organických fosfátů. Přímé měření při 340 nm je rychlejší a jednodušší. Při dodržování pH reakce je výsledná absorbance stabilní. Při snížení kyselosti může docházet ke spontánní redukci. Nevýhodou jsou větší interference při ikteru, lipémii a hemolýze. Vznik molybdenové modře se používá také k detekci fosforečnanů na filmech se suchými reagenciemi pomocí reflexní fotometrie.
Další typ reakcí fosforečnanů probíhá v kyselém prostředí s molybdenanem amonným a vanadičnanem amonným za vzniku žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné s absorpčním maximem 380 – 410 nm. Reakce může poskytovat falešně vyšší výsledky v důsledku potenciální hydrolýzy organických fosfátů.
Postup s tvorbou komplexu molybdátofosforečné kyseliny s bazickými barvivy se v našich laboratořích také používá. Fotometrická detekce komplexu s malachitovou zelení (více využívaná než rodamin B) se provádí při 640 nm.
Enzymových stanovení je celá řada i když vzhledem k vyšší ceně analýzy se v laboratořích nepoužívají. Jeden postup je založen na principu tvorby hypoxantinu z inosinu a fosfátu za katalýzy purinnukleosidfosforylázou.
V dalším kroku je hypoxantin oxidován xantinoxidázou na kyselinu močovou a vznikající peroxid vodíku mění chromogenní substrát N-etyl-N-(3-metylfenyl)-N-acetyletylendiamin na purpurový komplex měřený při 555 nm.
Jiný postup využívá enzymové kaskády glykogenfosforylázy, fosfoglukomutázy a glukóza-6-fosfátdehydrogenázy v přítomnosti glykogenu. S prvním enzymem se glykogen fosforyluje fosfáty ze vzorku na α-D-glukóza-1-fosfát, který se s druhým enzymem izomeruje na α-D-glukóza-6-fosfát a následuje redox reakce katalyzovaná třetím enzymem, kdy oxidací vzniká 6-fosfo-D-glukonát a současně se redukuje NADP⁺ na NADPH.
Kinetické měření při 340 nm lze použít i v levnější verzi enzymových reakcí, kdy se za katalýzy sacharózafosforylázou v prvním kroku fosforyluje sacharóza fosfáty ze vzorku na α-D-glukóza-1-fosfát (při štěpení vzniká D-fruktóza). Následně se uplatní fosfoglukomutáza, která jej izomeruje na α-D-glukóza-6-fosfát. Posledním krokem je redox reakce katalyzovaná glukóza-6-fosfátdehydrogenázou, kdy oxidací vzniká 6-fosfo-
D-glukonát a současně se redukuje NAD⁺ na NADH.

Izotachoforéza: využívá dělení iontů ve stejnosměrném elektrickém poli na základě rozdílných pohyblivostí. Tímto postupem lze kvantifikovat zvlášť ionty HPO₄^2- a H₂PO₄^-. Metoda se používá při základním a aplikovaném výzkumu.

Gravimetrie: je referenční metodou stanovení celkového fosforu (tedy i organického). Po mineralizaci kyselinou sírovou a dusičnou se fosfor vysráží jako chinolinfosfomolybdenát, vysuší a precipitát se stanoví gravimetricky.

Definitivní metoda stanovení anorganických fosfátů nebyla navržena, protože ID-MS postup má značné vychýlení. To je do značné míry způsobeno nejednoznačnou definicí anorganických fosfátů.

Biologická variabilita intraindividuální / interindividuální: 8,50 % / 9,40 %
Požadovaná preciznost / vychýlení: 4,30 % / 3,20 %
Požadovaná celková chyba: 10,20 %
Kritická diference (požadovaná nepřesnost, intraindividuální variabilita): 26,4 %
Toleranční limit EHK: sérum a plazma 15 %, moč 18 %.

Koncentraci fosfátů v séru snižují: acetazolamid, adrenalin, albuterol, alendronát, aqua carminativa, arginin, ATP, azathioprin, bilirubin (> 50 µmol/l), citronan, čokoláda (hořká), etanol, fenothiazin, fluoridy, fluosol-DA, furosemid, fytát, galiumnitrát, glukóza, hemoglobin (1 g/l), hlinité soli, hydrochlorothiazid, hydroxid hlinitý, inzulín, ketokyseliny, kofein, lipémie, lithium, manitol, menstruace, niacin, noradrenalin, orální kontraceptiva, pamidronát, poloha vleže, promethazin, prokain penicilin G, růstový hormon, těhotenství (také po porodu
a ukončení kojení), aj.
Koncentraci fosfátů v séru zvyšují: anabolické steroidy, anestetika, antikonvulsiva, askorbová kyselina, alanin, aldatens, cefotaxim, celková bílkovina (120 g/l), cidovir, cis-platina, EDTA, ergokalciferol, erytropoetin, etidronát, etretinát, foscarnet, fosfenytoin, fototerapie, gasterin, ILGF-1, hemoglobin (> 3,5 g/l), 1-α-hydroxyvitamin D, imunoglobuliny, izoniazid, medroxyprogesteron, metyltestosteron, mestranol, nafarelin, nikardipin, paraprotein, Phospho-Soda, primidon, superanabolon, takrolismus, triacylglyceroly (> 25 mmol/l), xylitol, aj.

Koncentraci fosfátů v moči snižují: alanin, alkoholismus, skladování vzorku bez okyselení, aj.
Koncentraci fosfátů v moči zvyšují: acetazolamid, anopyrin, aqua carminativa, asparagináza, dihydrotachysterol, dilthiazem, floridzin, glycin, hlinité soli, hydrochlorothiazid, hydrouhličitany, gasterin, kalcitonin, kortikosteroidy, metolazon, rtuťná diuretika, ortofosfát, tryptofan, valin, aj.