protrombin, FII, F2, koagulační faktor II. Jeho aktivní forma je faktor IIa neboli trombin, EC 3.4.21.5;

fibrinogenase, thrombase, thrombin-C, tropostasin 

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla > 1 min. Transport materiálu do laboratoře do 2 h. Stabilita plazmy je 4 h při 15 – 25 °C. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zamrazení plazmy se upřednostňuje opakovaná centrifugace a oddělení plazmy 0,5 – 1,0 cm nad suspenzí erytrocytů. Plazmu lze skladovat 4 týdny při teplotě -20 °C nebo 6 měsíců při teplotě -70°C . Pro následné zpracování zamrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu 5 min ve vodní lázni o teplotě 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

Protrombin je vitamin K dependentní, a je prekurzorem trombinu. Trombin je klíčový enzym koagulačních procesů. Je relativně stabilní, absorbovatelný bariumsulfátem. Minimální hemostatická hladina je udávaná 40%. V minulosti se místo faktor II deficitní plazmy používala bariumsulfátová plazma (zdroj faktorů I, V, VIII, XI, XII) a oxalátová plazma (zdroj faktorů VII a X).

V praxi se používají koagulační testy, založené na principu protrombinového času nebo aPTT (méně často), které měří funkční aktivitu. Vzorek plazmy se ředí pufrem (1:10) a smíchá se s FII deficitní plazmou. Po krátké inkubaci se přidá tromboplastin spolu s Ca²⁺ ionty; následně měříme dobu vzniku koagula. Aktivitu faktoru zjistíme odečtením z kalibrační křivky. Výsledky testu v některých případech mohou záviset na použitém tromboplastinu. Upřednostňuje se lidský rekombinantní tromboplastin, pomocí kterého naměřené výsledky více souvisí se situaci in vivo. Kalibrace se provádí pomocí kalibrační plazmy o známém obsahu (v %) FII. Postupuje se tak, že připravíme řadu ředění kalibrační plazmy s pufrem (např. 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/80, 1/100, 1/1000), čímž získáme vzorky o známé koncentraci (v případě 100% obsahu FII v kalibrační plazmě to bude 100%, 50%, 33%, 25%, 12,5%, 10%, 1%). Dále s každým ředěním provedeme test PT. Kalibrační závislost je log-log. Výchozí ředění a počet kalibračních bodů je možné přizpůsobit systému a citlivosti tromboplastinu. Důležité je, aby desetinásobné ředění zkušebního vzorku produkovalo prodloužení koagulačního času o více než 50%, např. když při ředění 1/10 je PT čas 40s, tak u ředění 1/100 by měl být minimálně 60s.

Nejčastější typ detekce u koagulačního testu je optický (turbidimetrie) a mechanický (kovová kulička v magnetickém poli). Obě metody mají své výhody i nevýhody. Optické metody jsou finančně méně náročné, jelikož stačí převážně 150 µl reakční směsi v kyvetě, kdež to u mechanické detekce je nutný objem větší, aby se kulička celá ponořila. Mechanická detekce na druhé straně není závislá na zbarvení, resp. zakalení vzorku (ikterické, chylózní, hemolytické vzorky), což lze u optické metody minimalizovat detekcí při 671 nm. Většina optických analyzátorů volí inflexní bod křivky (50 % absorbance), když počáteční absorbance se bere jako 0 % a konečná jako 100 %.

Chromogenní test využívá enzym Ecarin, extrahovaný z jedu Echis Carinatus, který specificky štěpí protrombin na meizotrombin. Ten specificky štěpí chromogenní substrát, za uvolnění para-nitroanilinu, a žluté zbarvení se detekuje fotometricky při 405 nm. Závislost absorbance je přímo úměrná. Mez detekce je ≤5 %; linearita je do 200 %; precíznost v serii je 2-5%, mezi seriemi je 3 - 6 %.

Imunologické testy měří množství protrombinu jako antigenu, a tudíž nic nevypovídá o koagulační aktivitě. V provedení ELISA je na mikrotitračních jamkách navázaná protilátka proti lidskému protrombinu. Po reakci se vzorkem a navázání protrombinu na protilátku se jamky promyjí a přidá se druhá biotinylovaná protilátka proti protrombinu. V dalším kroku se po promytí přidá streptavidin-peroxidázový konjugát a pro vizualizaci se použije TMB (tetrametylbenzidin), čímž vznikne modré zbarvení. Intenzita je přímo úměrná množství protrombinu ve vzorku. Senzitivita testu je 0.03 µg/ml, měřící rozsah je 0.031 µg/ml - 32 µg/ml, výtěžnost je81 - 107 %, precíznost v sérii je 4,8 %, mezi seriemi je 7,2%. Křížová reaktivita: trombin 70 %.

Intraindividuální CV je 5,9 %.

Aktivita koagulačních faktorů se může vyjadřovat v % nebo v IU/dl nebo IU/ml. To je důležité u kalibrační plazmy a tyto jednotky nelze zaměňovat. V případě jednotek IU/dl nebo IU/ml se jedná o hodnoty vztažené na mezinárodní standard. Vzhledem k SI se upřednostňuje IU/ml, případně kIU/l (resp. U/ml, případně kU/l).

Snížení hodnot: chybný odběr krve, nepromíchání vzorku ihned po odběru, nedodržení objemu krve (nenaplnění zkumavky), cvičení, malnutrice, hypoalbuminémie, fyziologicky u novorozenců, dlouhodobé vystavení vyšším teplotám, horečka, průjem, alkohol, vyšší hematokrit, léčba antagonisty vitaminu K (warfarin), DIC (diseminovaná intravaskulární koagulace), fibrilace síní, těžší poruchy jaterního parenchymu, hyperfibrinolýza, fibrinolytika, imunokoagulopatie (zejména přítomnost protilátek proti protrombinu), dysprotrombinemie, hypovitaminóza K a celá řada léků: arixtra, amoxicilin, aspirin, augmentin, dexametazon, diclofenac, digoxin, furosemid, heparin, lactuloza, omeprazol, prednizon, ramipril atd.

Zvýšení hodnot: mutace genu pro protrombin, dlouhá komprese při odběru, tělesné cvičení, dlouhodobá rybí dieta, xantin, nikotin, nedodržení objemu krve (přeplnění zkumavky), nižší hematokrit, hemolýza, chybná centrifugace (plazma bohatá na trombocyty), těhotenství, imobilizace, obezita, ACTH, barbituráty, antiepileptika, glukokortikoidy, karbamazepin, koenzym Q10, hormonální antikoncepce, merkaptopurin, penicilin, vitamin K acetaminophen, .