Thyroglobulin Antibody, Antithyroglobulin Antibody, Tg Ab, Thyroid Antiglobulin Antibody

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát lithný nebo EDTA). Stabilita protilátek 8 – 48 h při 20 – 25 °C, 2 - 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C. Ředěné vzorky lze skladovat v chladu 6 dní. Opakované zamrazení se nedoporučuje.

Pasivní hemaglutinace využívá taninované erytrocyty potažené tyreoglobulinem. Po smíchání se vzorkem se stanovované protilátky naváží na zakotvený antigen a dochází k aglutinaci. Sérum je nutné před reakcí deaktivovat při 56 °C, aby se odstranila interference komplementu a TBG. Obvykle se provádí ředění a sleduje se titr, při kterém ještě dochází k hemaglutinaci.

Metody, které používají citlivější markery, než erytrocyty, jsou také specifičtější.

IRMA v sendvičovém uspořádání začíná imunoreakcí (1 h 37 °C nebo 90 min za laboratorní teploty + třepání) ředěných stanovovaných protilátek s tyreoglobulinem, vázaným na stěnách zkumavek. Po promytí (3x) se přidá ¹²⁵I-protein A, následně se roztok inkubuje 1 h při 37 °C (nebo za laboratorní teploty + třepání). Po odstátí (případně i promytí) se měří radioaktivita ve zkumavkách (1 min), která je přímo úměrná množství stanovovaných protilátek. Rozsah metody je 2,02 – 3000 kU/l. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 19,7 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 2,02 kU /l. Preciznost v sérii ≤ 10,4 %, mezi sériemi je 10,2 %. Ruší hemolýza, chylozita i ikterus. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Pokud se značení a reakce se provádí volně v roztoku za vzniku precipitátu ¹²⁵I-tyreoglobulin–anti-TG–protein A, dosáhne se citlivosti až 0,2 kU/l.

ELISA probíhá v mikrotitračních destičkách potažených lidským tyreoglobulinem. Po navázání stanovované protilátky (30 min, 37 °C) a promytí (3x) se váže ve tmě na druhý paratop protilátka vůči IgG, značená POD (30 min, laboratorní teplota). Po promytí (3x) se enzym detekuje reakcí s tetrametylbenzidinem (15 min, laboratorní teplota) ve tmě, která se zastaví stop činidlem (0,4 M H₂SO₄). Rozsah metody je 10 – 2000 kU/l (Jiné soupravy až do 9000 kU/l). Uváděná senzitivita je 97,1 % a specifita 87,5 %. Preciznost v sérii je 1,2 – 2,1 %, mezi sériemi 3,9 – 8,5 %. Jako substrát lze použít i o-fenylendiamin. Detekční limit je pak 3- 5 kU/l.

Jiný postup využívá mikrotitrační destičky potažené streptavidinem. Do jamek se pipetuje ředěný vzorek nebo kalibrátor a poté tyreoglobulin s biotinovou kotvou. Po inkubaci a propláchnutí se přidá protilátka proti lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Opět se inkubuje a propláchne, pak se přidá substrát tetrametylbenzidin s H₂O₂ a barevná reakce se posléze zastaví stop činidlem (1 M HCl). Měří se bichromaticky 450/620 nm. Šestibodová kalibrace dovoluje měření do 2500 kU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 1,94 kU/l. Preciznost v sérii je 3,6 – 5,0 %, mezi sériemi 4,0 – 5,3 %. Chylozita a hemolýza stanovení ruší, ale nevadí anti-TPO ani vysoký RF.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný fosfátový pufrem a poté latexové mikročástice potažené purifikovaným tyreoglobulinem. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgG značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 2 – 1000 kU/l. (Vzorky s hodnotami anti-TG > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po ředění musí být > 25 kU/l). Preciznost v sérii je 4,1 – 7,4 %, celková preciznost metody je 7,0 – 12,9 % linearita ředění 84,3 – 109,9 %. Analytická senzitivita je 2 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 29 min mezi anti-TG ze vzorku a polyklonální anti-TG připojenou na sběrný protein o vazbu na tyreoglobulin-Eu³⁺. Měřený signál je po kompetitivní imunoreakci nepřímo úměrný hladině anti-TG. Na základě jednobodové kalibrace rozsah měření je 10 – 850 kU/l (po automatickém ředění až do 500000 kU/l). Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 33 kU/l. Preciznost v sérii 1,5 – 3,5 %, mezi sériemi 6,8 – 20 %. Linearita ředění je 85 – 112 %. Anti-TPO neruší do 1000 kU/l, tyreoglobulin do 150 µg/l, hemoglobin < 2,5 g/l, triacylglyceroly < 5,6 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá lidský tyreoglobulin zakotvený na paramagnetických částicích ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-TG a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 1 – 1000 kU/l (Vzorky s hodnotami anti-TG > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x, při hodnotách > 10000 kU/l se ředí manuálně). Preciznost v sérii 1,7 – 6,6 %, celkově 2,3 – 8,2 %; linearita 93,5 – 117,9 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 0,31 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,07 kU /l. Efekt nadbytku protilátek nebyl pozorován ani při hodnotě 100000 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Podobný princip zábleskové luminiscence, avšak v kompetitivním uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Protilátka proti tyreoglobulinu ve vzorku soutěží s polyklonální lidskou anti-TG protilátkou vázanou na polyklonální kozí protilátku vůči lidskému IgG kovalentně vázanou na paramagnetické latexové částice o omezené množství lidského tyreoglobulinu, značeného esterem akridinu. První krok je temperování vzorku na 37 °C (4,6 min). Dále se pipetuje lidský tyreoglobulin, značený esterem akridinu a roztok se temperuje na 37 °C (3 min). Nakonec se přidá polyklonální lidská anti-TG protilátka vázaná na polyklonální kozí protilátku vůči lidskému IgG kovalentně vázanou na paramagnetické latexové částice a nechá se proběhnout kompetitivní imunoreakce (6,3 min, 37 °C). Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou anti-TG > 500 kU/l se ředí 5x. Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 30 kU/l. Preciznost v sérii 3,9 – 6,3 %, mezi sériemi 4,2 – 7,0 %. Linearita ředění je 80,8 – 117,2 %, zpětný výtěžek 87,3 – 102,3 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené tyreoglobulinem naváže anti-TG během první inkubace (10 min) a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) polyklonální kozí protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině anti-TG. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 5 – 5000 kU/l (vzorky s koncentrací anti-TG přesahující rozsah měření lze ředit diluentem dle potřeby). Efekt nadbytku protilátky nebyl pozorován do 259000 kU/l. Analytická citlivost je 5 kU/l, funkční citlivost 10 kU/l. Preciznost v sérii 2,3 – 8,6 %, mezi sériemi 4,4 – 10,8 %. Linearita ředění je 89,6 – 109,1 %, zpětný výtěžek 95 – 109 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Až do koncentrace 25 mg/l nebyla zjištěna interference TPO.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. Protilátky proti tyreoglobulinu se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin bez protilátek anti-TG/anti-TPO váží na vysoce purifikovaný tyreoglobulin imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se na druhé vazebné místo anti-TG naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-TG ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 3000 kU/l, avšak do hodnoty 55552 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Sérum je před analýzou automaticky ředěno analyzátorem 100x a diluent s bílkovinnou matricí bez protilátek anti-TG a anti-TPO se stabilizátorem je součástí soupravy. V případě výsledku > 3000 kU/l se ředěný vzorek dále naředí diluentem v poměru 1 + 20 a výsledek z analyzátoru se násobí 21x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 2,2 kU/l. Preciznost v sérii (43 kU/l) < 5,0 %, v čase (381 kU/l) < 5,9 %, zpětný výtěžek 73 -103 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l), hemoglobin (< 3,81 g/l), lipidy (< 50 g/l).

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek a paramagnetické částice potažené tyreoglobulinem. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá tyreoglobulin značený ALP. Následuje druhá inkubace, separace v magnetickém poli a promytí. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-TG. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,9 – 2500 kU/l. Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 350000 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovaným tyreoglobulinem a stanovované protilátky se vážou na antigen. Po přidání protilátek anti-TG značených ruthéniovým komplexem dochází ke kompetici o vazebná místa na tyreoglobulinu a imunokomplex se naváže na paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-TG ve vzorku. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 300 kIU/l) neruší, ale vadí tyreoglobulin > 2 mg/l. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 10 – 4000 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích není možné (autoprotilátky odpovídají nelineárně). Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je < 10 kU/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 5,6 %, mezi sériemi 2,1 – 8,7 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.

Mezinárodní standard je označen MRC 65/93.

Zvýšené hodnoty se objevují i u zdravých ve vyšším věku (6 – 7 %).