kyselina mléčná
kyselina 2-hydroxypropanová
Stanovuje se pouze v plazmě (vyjímečně v likvoru nebo moči). Odběr se provádí do skleněných nebo plastových nádobek bez úpravy nebo s protisrážlivým činidlem (EDTA) a antiglykolytickým činidlem (NaF - pozor, jed!). Za nejlepší stabilizátor laktátu se považuje jodoctan sodný, který se často používá v kombinaci se šťavelanem. Odběr se provádí bez naložení turniketu. Pokud je manžeta použita, odebrat krev až 2 min po uvolnění. Transport se uskutečňuje na ledové tříšti. Je třeba zabránit hemolýze (falešně snižuje výsledky), ruší také ikterus. Separaci korpuskulární fáze je nutné provést do 15 min od odběru, stanovení nejdéle do 2 h od odběru. Je možné provést deproteinaci kyselinou trichloroctovou.
Stabilita při stanovení v plazmě nebo likvoru: +20 až +25 °C 2 h, +4 až +8 °C 24 h (až 3 dny), -20 °C 6 týdnů. Stanovení může být součástí vyšetření spektra organických kyselin v moči, kdy je stabilita laktátu při +20 až
+25 °C 24 h, +4 až +8 °C 5dnů, -20 °C 5 let.
Intravenózní injekce nebo infuze (hydrogenkarbonát sodný, glukóza) modifikující acidobazickou rovnováhu mohou způsobit změnu koncentrace laktátu. Zvýšení laktátu způsobí také hyperventilace nebo podání adrenalinu. Některé metody může ovlivnit vysoká koncentrace bilirubinu a u enzymových metod může rušit pyruvát ve vysoké koncentraci.
Spektrofotometrie:
Nejvíce využívané je enzymové stanovení laktátu laktátdehydrogenázou, kdy se v oxidoredukční reakci fotometricky sleduje při 340 nm vznik NADH, který se tvoří při oxidaci laktátu na pyruvát pomocí NAD+. Metoda je rychlá a spolehlivá, pokud se stanovení provádí neprodleně po odběru. Na automatizovaných analyzátorech je k dispozici v kinetické i E.P. (v přítomnosti semikarbazidu) verzi. Posunutí reakční rovnováhy ve směru pyruvátu se dosahuje nadbytkem NAD+ v mírně alkalickém prostředí uhličitanového pufru (pH 9,0 – 9,6)
a odčerpáváním vznikajícího pyruvátu v následné reakci s L-glutamátem, katalyzované ALT. Výtěžnost 96 –
98 %, detekční limit 0,24 mmol/l, CV 2 – 5 %.
Jiným postupem je dvoubodová kinetická metoda, která ke spotřebě vznikajícího pyruvátu používá reakce
s hydrazinem v tris(hydroxymetyl)aminometanovém pufru. Tato metoda je lineární jen do koncentrace laktátu
5 mmol/l a u zvýšených hodnot vyžaduje ředění vzorku. CV mezi sériemi je 8,9 % při koncentraci 4 mmol/l laktátu.
Laktát lze také oxidovat na pyruvát vzdušným kyslíkem za katalýzy laktátoxidázou. Vzniklý peroxid vodíku reaguje s 4-aminoantipyrinem a 1,7-dihydroxynaftalenem v přítomnosti peroxidázy na červené chinonmonoiminové barvivo, které se kvantifikuje fotometricky při 540 nm. Tento postup se používá i při analýze suchými reagenciemi v želatinových filmech (reflexní fotometrie). Peroxid vodíku lze stanovovat také přímo polarograficky laktátovou elektrodou (viz dále).
Využití klasických oxidačních činidel jako KMnO4 nebo MnO2 má jen historický význam. I když byl postup spolehlivý a citlivý, byl značně zdlouhavý. Podle podmínek reakce vznikal acetaldehyd a buď CO nebo CO2. Všechny tři reakční produkty bylo možné stanovit i když GLC stanovení acetaldehydu má problém ve snadné kontaminaci kolony a měření oxidů uhlíku plynoměrnou analýzou není v běžné laboratoři dostupné.
Fluorimetrie: detekci vznikajícího NADH lze provádět při 450 nm fluorimetricky. Uspořádání analytických reakcí je stejné jako u předchozích fotometrických postupů, kdy vzniká NADH. Souprava je komerčně dostupná.
Polarografie: Měrná platinová elektroda je potažena laktátoxidázou (odtud název „laktátová“ elektroda). Při konstantním potenciálu (přepětí 0,7 V) proti referenční Ag/AgCl elektrodě je vzniklý proud úměrný koncentraci peroxidu vodíku. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,0 – 5,8 %, mezi sériemi 0,9 – 10,0 %.
Velmi rychlý postup umožňuje měření laktátu z celé krve v elektrochemických analyzátorech. Elektroda je vlastně modifikací Clarkovy kyslíkové elektrody. Jedinou stinnou stránkou je krátká životnost laktátové elektrody (asi 1 měsíc) a její poměrně vysoká cena.
Potenciometrie:
Využívá se ferikyanidu jako mediátoru elektronů. Laktát se laktátoxidázou (LO) oxiduje na pyruvát a současně se ferikyanid redukuje na ferokyanid. Ten při zpětné oxidaci předává elektrony na platinovou katodu, kde dochází k jejich spotřebě při redukci kyslíku na vodu. Tento postup lze automatizovat. Analýza je spolehlivá, rychlá a citlivá, ale zařízení není běžně dostupné. Linearita do 20 mmol/l, CV mezi sériemi 1,7 – 8,4 %.
Byl popsán také postup s grafitovou elektrodou potaženou laktátoxidázou a peroxidázou, kdy jako mediátor elektronů byl využitý systém ferrocen-ferricin.
Izotachoforéza: umožňuje vydělit a kvantifikovat laktát na základě jeho pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli při udržování konstantního proudu.
Plynová chromatografie: GLC stanovení reakčního produktu acetaldehydu velmi omezuje životnost kolony.
HPLC se používá ke stanovení v moči. Laktát se derivatizuje fluorescenčním činidlem 4-nitro-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazolem a detekuje fluorimetricky (excitace 491 nm, emise 547 nm). Výtěžnost 96,9 – 104,9 %, reprodukovatelnost v sérii CV 0,8 %, mezi sériemi 14,4 %.
Žádná metoda nebyla zatím vybrána jako referenční nebo definitivní i když byly práce zabývající se také stanovením HPLC-IDMS. Patrně hlavním důvodem je malá stabilita laktátu v biologických vzorcích, která nedovoluje dosáhnout analytických parametrů referenční nebo definitivní metody. Referenční materiál není
v nabídce.
Biologická variabilita intraindividuální / interindividuální (%): 27,20 / 16,70.
Požadovaná nepřesnost / bias (%): 13,60 / 8,00.
Požadovaná celková chyba (%): 30,40.
Kritická diference (požadovaná nepřesnost, intraindividuální variabilita, v %): 84,2.
Běžně dosahované CV při koncentraci 1,7 mmol/l je 3,5 – 9,0 %.
Toleranční limit EHK: 18 %.
Koncentraci laktátu v séru snižují: hemoglobin (velmi slabá hemolýza), kyselina jablečná, kyselina pyrohroznová, morfin, aj.
Koncentraci laktátu v séru zvyšují: adrenalin, alanin, cvičení, etanol, etylenglykol, fruktóza, glukóza, hemoglobin (metabolická aktivita buněk), hladovění, hydrouhličitan, hyperventilace, kyselina jódoctová, laktóza, noradrenalin, nutramin, obezita, pláč, sorbit, stání vzorku (> 15 min), venostáze, xylitol, aj.
