osteocalcin, BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate protein, Bglap1, Bglap2, BGP, Bgpr, Bgpra, Bone Gla-protein, GLA, mOC-A, OC, OCN, OG1, RP11-54H19.5, PMF1

Stanovení se provádí v plazmě (heparinát sodný) nebo v séru. Při odběru vzorku je třeba zabránit hemolýze. Odběrovou nádobku ihned umístit do ledové lázně a urychleně transportovat do laboratoře. Zde okamžitě centrifugovat v chlazené centrifuze. Doporučen přídavek aprotininu. Nejlépe odběr nalačno mezi 8. a 9. h.

Maximální čas od získání do zpracování vzorku plazmy je 2 h při doporučené teplotě 4°C. Stabilita v plazmě při 20 – 25 °C 5 min, při 4 – 8 °C 2 h, při -20 °C 30 dnů. V séru při 20 – 25 °C 4 h (přídavkem aprotininu lze prodloužit na 8 h), při 4 – 8 °C 24 h, při -20 °C 1 rok.

Osteokalcin je možné měřit i v moči, kultivačních buňkách nebo kultivačním supernatantu.

RIA kompetitivní metoda vychází z toho, že standard, resp. vzorek osteokalcinu soutěží o volná místa na směsi protilátek vůči osteokalcinu značených ¹²⁵I nebo neznačených. Po inkubaci 2,5 h při 37 °C se přidá druhá protilátka a precipitační činidlo. Inkubuje se 10 min za laboratorní teploty, pak se sraženina centrifuguje a po dekantaci (nebo odstátí) se měří gama-počítačem. Metoda dovoluje měřit koncentrace 1 – 50 µg/l. Preciznost v sérii je 6 %, mezi sériemi 9 %.

IRMA postupy mají první protilátku vůči osteokalcinu vázanou na zkumavku nebo kuličku. Druhá protilátka je značená ¹²⁵I. Imunoreakce trvá alespoň 2 h za laboratorní teploty. Metody dovolují měření v intervalu 4,7 – 160, resp. 5,5 – 280, resp. 0,6 – 61 µg/l. Preciznost v sérii je 1,4 – 10,6 %, mezi sériemi 2,1 – 6,1 %. Detekční limit je od 0,04 (po inkubaci 18 h!) do 1,2 µg/l.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou protilátkou vůči osteokalcinu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a poté druhá protilátka vůči osteokalcinu s křenovou peroxidázou. Po inkubaci 2 h a promytí 3x se přidá chromogen dimetylbenzidin a reakce probíhající ve tmě je zastavena po 30 min stop činidlem (1 M HCl). Měření při 450 nm nutno provést do 1 h. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Kalibrace je šestibodová. Detekční limit je 0,8 µg/l, zpětný výtěžek 97 – 111 %, linearita ředění 77,7 – 100 %, interval měření 0,8 – 75 mg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 625 µg/l. Preciznost v sérii 3,1 – 4,7 %, mezi sériemi 3,5 – 5,6 %. Silná hemolýza a lipémie stanovení ruší.

Rychlejší varianta používá mikrotitrační destičku s jamkami potaženými streptavidinem. Po přidání standardu nebo vzorku se přidá směs biotinylované protilátky vůči osteokalcinu a monoklonální protilátky vůči osteokalcinu s POD značkou. Po inkubaci 1 h a pětinásobném propláchnutí se přidá substrát dimetylbenzidin a inkubuje se 20 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (ředěná H₂SO₄) a měří se do 10 min při 450 nm (lze i bichromaticky proti 595, 620, 630 nm). Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,31 – 64 µg/l se zpětným výtěžkem 89 – 102 %. Linearita ředění je 87 – 101 %. Preciznost v sérii 4,7 – 5,0 %, mezi sériemi 5,7 – 8,3 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1250 µg/l. Zbytky polyesterové pryskyřice snižují aktivitu křenové peroxidázy.

Při jiném ELISA postupu se v mikrotitračních destičkách zakotví myší monoklonální protilátka proti osteokalcinu až během analýzy a to až po pipetování standardu nebo vzorku. Po inkubaci 2 h a trojnásobném promytí se přidá kozí protilátka vůči myšímu IgG značená ALP. Po inkubaci 1 h a trojnásobném promytí se přidá substrát (p-nitrofenylfosfát), inkubuje se 35 – 40 min a přidá se stop činidlo (0,5 M NaOH). Měření se provádí při 405 nm do 15 min podle šestibodové kalibrační křivky. Detekční limit je 0,45 µg/l. Preciznost v sérii 4,8 – 10 %, mezi sériemi 4,8 – 9,8 %. Vzorky s koncentrací > 32 µg/l nutno ředit 2x. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 14 min. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k osteokalcinu) přímo úměrný hladině osteokalcinu. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,4 – 270 µg/l (po automatickém ředění až do 2700 µg/l). Analytická citlivost je 0,4 µg/l, funkční citlivost 1,4 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 550 µg/l. Preciznost v sérii 0,7 – 2,9 %, mezi sériemi 0,7 – 6,5 %. Hemoglobin 2,5 g/l vede k výrazně nižším výsledkům (hemolytické vzorky nelze měřit!); triacylglyceroly do 5,6 mmol/l a bilirubin nevadí. Linearita ředění je 70 – 110 %.

CLIA je dvoustupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže osteokalcin (inkubace 10 min). Pak se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 20 minut; po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině osteokalcinu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,5 – 300 µg/l (vyšší koncentrace osteokalcinu se ředí 10x). Analytická citlivost je ≤ 0,5 µg/l, funkční citlivost 3,0 µg/l. Efekt nadbytku antigenu do 1500 µg/l nebyl pozorován. Preciznost v sérii 3 – 8 %, mezi sériemi 4 – 9 %; zpětný výtěžek 84 – 115 %. Hemolýza ruší, lipémie a ikterus nevadí.

Chemiluminiscenční analýza je jednostupňová imunoreakce sendvičového typu, kdy se přidává k polystyrenové kuličce s kotvící myší monoklonální protilátkou vůči osteokalcinu stanovovaná bílkovina a následně roztok polyklonální králičí protilátky vůči osteokalcinu značené ALP (z telecího střeva) v pufru. Po 30 minutové inkubaci při 37 °C se nenavázaná druhá protilátka odstraní promytím při centrifugaci. Přidá se substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s ALP za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za produkce záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci osteokalcinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Interval měření je 2 – 100 µg/l, analytická citlivost (limit blanku) 0,19 µg/l, mez detekce 0,45 µg/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 0,81 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 60300 µg/l. Přítomnost bilirubinu do 171 µmol/l, hemoglobinu do 1,5 g/l a triacylglycerolů do 33,9 mmol/l stanovení neruší. Preciznost metody v sérii 2,5 – 4,8 %, celková 7,0 – 10,4 %. Zpětný výtěžek stanovení 83 – 100 %, linearita ředění 103 – 130 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou(ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální protilátkou proti N-MID fragmentu osteokalcinu (aminokyseliny 1 – 43) a monoklonální protilátkou proti N-MID fragmentu osteokalcinu značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají biotinylované paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci osteokalcinu ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,5 – 300 nmol/l. Vyšší koncentrace se ředí 5x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,5 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 4,1 %, mezi sériemi 6,6 %. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. U pacientů, kteří byli léčeni monoklonálními myšími protilátkami, nebo dostali protilátky k diagnostickým účelům, se projevila interference v důsledku extrémně vysokého titru těchto protilátek vůči streptavidinu.

Toleranční limit EHK: 17 %.

Výsledky snižují: hemolýza (degradace erytrocytární proteázou), maraton, těhotenství (1. a 2. trimestr), EDTA, citronát, heparinát lithný, oxalát, bilirubin, opakované rozmrazení, alkoholismus, antagonisté vitaminu K, glukokortikoidy, kortikosteroidy, thiazidy, warfarin.  

Výsledky zvyšují: puberta, kalcitriol, těhotenství (3. trimestr), menopauza, hojení fraktur, transplantace ledviny, cvičení (až o 50 %), laktace, fosfáty, fluoridy.

Další lékové interference: kumarinová antikoagulancia, estrogeny, kalcitonin, perorální kontraceptiva, tamoxifen.