lipoprotein (a), lipoproteinový antigen, lipoprotein-a, LPA

Odebírat po 12 h lačnění. Stabilizace přídavkem thiomersalu.
Stabilita: 20 – 25 °C 24-48 h, 4 – 8 °C 7-15 dní, -20 °C 4-12 týdnů.
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA nebo citran). Stanovení ovlivňuje poloha (pozice vsedě – výsledky nižší), dieta, rasa a opakované zamrazení. Při vědomí relativní stálosti plazmatických hladin Lp(a) stačí kvantitativní vyšetření provést u každého jedince pouze jednou za život.

Velmi významným a charakteristickým rysem Lp(a) je jeho heterogenita.

Lp(a) lze prokázat při určitém uspořádání běžnou elektroforézou lipoproteinů na agaróze jako samostatný pás, semikvantitativně protisměrnou elektroforézou nebo imunochromatografií. Kvantitativní stanovení hladiny Lp(a) se provádí imunochemickými metodami; při nedostatečné standardizaci je však velkým problémem vzájemná porovnatelnost naměřených údajů.

Radiální imunodifuze je jednoduché stanovení, které nevyžaduje ředění vzorků; lze použít jak polyklonálních, tak směsi monoklonálních protilátek. Stanovení je časově náročné a nepoužitelné pro velké série. Analytická citlivost je nízká a rozdílná vůči různým velikostem částic Lp(a) (menší nadhodnoceny, větší podhodnoceny).
Elektroimunodifuze koreluje dobře s citlivějšími technikami (např. ELISA); lze použít polyklonálních protilátek. Stanovení je časově náročné a nepoužitelné pro velké série. Analytická citlivost je nízká. Rozsah metody je 84 – 580 mg/l.
Imunonefelometrické a imunoturbidimetrické metody jsou rychlé, jednoduché a nejméně náročné pro laboratoře co do technického vybavení (turbidimetrie). Reprodukovatelnost je dobrá; lze je snadno automatizovat a mají dobrou korelaci s RIA, IRMA, ELISA metodami. Latexová aglutinace může eliminovat nespecifickou precipitaci, protože zejména imunonefelometrie je vysoce sensitivní k rozdílnostem ve velikosti Lp(a) částic. Senzitivita není jasně definovaná, protože různé sérové matrice mohou stanovení nespecificky ovlivnit. Pro imunoturbidimetrii je reprodukovatelnost CV v sérii 1,6 – 5,5 %, mezi sériemi 2,8 – 10,7 %. Při kinetické nefelometrii byl limit detekce 10 mg/l, rozsah metody 10 -1280 mg/l, reprodukovatelnost CV v sérii
1,0 – 2,1 %, mezi sériemi 1,5 – 6,9 %.
RIA a IRMA jsou vysoce sensitivní, lehce automatizovatelné a s dobrou reprodukovatelností. Kalibrace mají omezenou dobou použití a měření probíhá v duplikátu. Reprodukovatelnost IRMA CV < 5 %.
ELISA je dosud nejpoužívanější technika stanovení Lp(a), nejčastěji v sendvičovém uspořádání. Metoda je vysoce sensitivní, lehce automatizovatelná a s dobrou reprodukovatelností. Výsledek závisí na detekčním záchytném systému. ELISA se provádí buď s monoklonálními protilátkami proti jednotlivým epitopům lipoproteinu(a) nebo sendvičová ELISA s kotvící protilátkou vůči lipoproteinu(a) a signální protilátkou proti
Apo B. Značkou je obvykle peroxidáza, substrátem tetrametylbenzidin a detekce se provádí při 405 nm. Repreodukovatelnost CV v sérii 4 – 6 %, mezi sériemi 7 – 9 %. Detekční limit je < 50 mg/l. Rozsah metody do 600 mg/l.
DELFIA je v sendvičovém provedení s kotvící protilátkou proti Lp(a) a druhou protilátkou proti Lp(a), značenou Eu³⁺ ve formě chelátu s N¹-(p-izothiokyanatobenzyl)-dietylentriamin-N¹,N²,N^3,3-tetraoctovou kyselinou. Fluorescence se detekuje při 280 nm. Reprodukovatelnost CV v sérii 2,7 – 7,1 %, mezi sériemi 7,1 – 15,0 %, výtěžnost 93,8 – 106,7 %. Detekční limit je 2,5 mg/l a rozsah metody do 1900 mg/l.
Imunobloting na nitrocelulózové membráně. Membrána byla následně inkubována s myší monoklonální protilátkou proti Lp(a) a po promytí s druhou kozí anti-myší protilátkou značenou ALP. Vybarvení se provedlo
v nitrotetrazoliové modři a 5-brom-4chlor-3-indoyl-fosfátu. Reprodukovatelnost metody dosáhla CV 5 – 8 %.

Hlavní zvláštnosti imunochemického stanovení Lp(a) jsou: vysoký stupeň homologie Lp(a) a plazminogenu, výrazný polymorfismus jednotlivých izoforem Lp(a) s výraznými odchylkami co do velikosti molekuly (93% evropské populace představují heterozygoti s kombinací malých a velkých izoforem) a distribuce Lp(a) v séru mezi frakcemi lipoproteinů o rozdílné hustotě.
Je třeba zohlednit citlivost příslušné metody na izoformy Lp(a).
Při imunochemickém stanovení koncentrace lipoproteinu Lp(a) lze narazit na řadu problémů: jak kalibrovat, výběr vhodné protilátky a volba metody, která by neměla být závislá na polymorfismu Lp(a).

Je také možné separovat ostatní lipoproteiny ultracentifugací a pak stanovit cholesterol v Lp(a).

Intraindividuální variabilita je 8,5 – 26,7 %, interindividuální variabilita až 85 %.
Standardizace dosud není. Neexistuje standardizační protokol pro izolaci částic Lp(a), byly zkoušeny různé techniky - všechny jsou velmi problematické. Referenční interval závisí na použité metodě.
Tolerační rozmezí EKK je 40 %.

Výsledky stanovení lipoproteinu (a) snižují: aferéza, etanol, cvičení, hemodialýza (diabetická nefropatie), IGF-I, IL-3, intralipid, kouření, lipémie, obezita, opakované zamražení, plazmaferéza, rybí olej, ztráta hmotnosti, aj.
Výsledky stanovení lipoproteinu (a) zvyšují: česnek, hemodialýza (chronické renální selhání), kouření, menopauza, peritoneální dialýza, puberta, rodové dispozice, růstový hormon, těhotenství, aj.