reticulocytes

Pro vyšetření se používá nesrážlivá krev s draselnými solemi kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA). Vyšetření se provádí jak z venózní, tak z kapilární nesrážlivé krve. Bezprostředně po odběru je nutné důkladné promíchání krve s antikoagulačním činidlem několikanásobným převrácením zkumavky. Transport materiálu nesmí být delší než 2 h při 15 – 25 °C. Stabilita materiálu je 5 h při 15 – 25 °C a 3d při 4 – 8 °C. Nedodržení poměru s antikoagulačním činidlem může vést ke vzniku sraženiny, nebo k ovlivnění morfologie erytrocytů vysokou koncentrací solí.

Retikulocyt je vývojové stádium erytrocytů, které vzniká z ortochromního erytroblastu po vypuzení jádra. Obsahuje zbytky ribozomů, endoplazmatického retikula a cytoplazmatické RNA, které se supravitálním barvením znázorňují v podobě zrn nebo vláken. Retikulocyty je možné stanovit manuálně nebo na analyzátorech.

Manuální stanovení retikulocytů je založeno na supravitálním barvení např. brilantkrezolovou modří, metylenovou modří apod. Samotné vyšetření je možné provést dvojím postupem.

Supravitální barvení ve zkumavce – ve zkumavce smícháme 2 kapky krve s jednou kapkou vodného roztoku brilantkrezolové modři s přídavkem síranu hořečnatého a kyseliny citronové při pH 7; nechá se 20 min inkubovat při laboratorní teplotě, kdy dojde k probarvení substancí v retikulocytech. Po zhotovení nátěru na podložní sklíčko, a po zaschnutí, se pod imerzním objektivem zjiš
euje počet retikulocytů na 1000 erytrocytů.

Barvení na podložném sklíčku – používá se roztok brilantkrezolové modři v absolutním alkoholu, který se nanese na podložní sklíčko a nechá se zaschnout. Kapka krve se nanese na takto připravené sklíčko, přiklopí se druhým obarveným sklíčkem a nechá se stát při laboratorní teplotě 2 – 3 min. Potom se sklíčka oddálí a z části krve se zhotoví krevní nátěr, ve kterém se spočítají retikulocyty.

Analyzátory využívají při stanovení retikulocytů optickou detekci na principu průtokové cytometrie. Analýza může být plně automatická, nebo s manuálním předběžným připravením vzorku (obarvení ve zkumavce).  Po nasátí vzorku analyzátorem je ředěná suspenze buněk vháněná do průtokové cely, kde jsou buňky vystaveny úzkému paprsku světla, nejčastěji laseru. Buňky jsou v průtokové cele řazeny jednotlivě za sebou pomocí hydrodynamické fokusace. Buňka, která vstoupí do cesty paprsku světla, snižuje jeho optickou hustotu a způsobuje jeho rozptyl, který je detekován pod různými úhly. Detekce ve směru světelného paprsku poskytuje informace o počtu. Detekce v různých úhlech (rozptýlené světlo) poskytuje údaje o vnitřní struktuře elementů. U moderních analyzátorů je použité fluorescenční barvivo (propidiumjodid, polymethinová barviva), které má afinitu k RNA.

Výsledky se udávají jako relativní hodnota, tj. poměr počtu retikulocytů na 1000 erytrocytů a/nebo absolutní počet, při známé hodnotě počtu erytrocytů.

Modernější analyzátory dokážou z naměřených údajů vyhodnotit i další morfologické charakteristiky retikulocytů jako jsou: Ret-Hb – obsah hemoglobinu v retikulocytech; RPI – index produkce retikulocytů; MCVr – střední objem retikulocytů; dále dle intenzity fluorescence dokážou rozlišit retikulocyty s nízkým, středním a vysokým poměrem fluorescence (mladší retikulocyty vykazují vyšší fluorescenci); atd. Tyto údaje mají vysokou vypovídací hodnotu o aktuální erytropoéze.

Standardizace je poměrně složitá, o čemž svědčí i vysoká hodnota tolerančního limitu v EHK, která je 50%. Preciznost za podmínek reprodukovatelnosti dosahuje 15 %. Měřící rozsah se pohybuje v rozmezí 0 – 0,250.

Stanovení na automatech může být plně automatické, nebo tzv. poloautomatické. U poloautomatů je nutné vzorek krve nejdříve inkubovat se supravitálním barvením a potom se změří v speciálním měřícím režimu analyzátoru, který je schopný na základě interakce jednotlivých buněk se světelným paprskem rozlišit retikulocyty. V plně automatických analyzátorech se využívají většinou fluorescenční barviva.

Hodnoty snižuje: pozdější zpracování vzorků (postupné zrání retikulocytů), radiační teriapie, deficit vitaminu B12, deficit folátů.

Hodnoty zvyšuje: alkoholizmus, tělesné cvičení, těhotenství, krvácení (3. – 4. den), erythropoietin, interleukin-3, po fluoresceinu, přítomnost bazofilního tečkování erytrocytů (u talasemie, dyserytropoetických stavů, jaterních onemocnění), přítomnost Howell-Jollyho tělísek, Heinzových tělísek, inkluze hemoglobinu H, Pappenheimerových tělísek, malárie, delší pobyt ve vyšších nadmořských výškách.