Anti-HBsAg antibody, Hepatitis B Surface Antigen antibody, Hepatitis B surface Ag antibody, Hepatitis B Surface Antigen protein, Hepatitis B Surface Antibody

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: heparin, citrát). Stabilita v séru při laboratorní teplotě 2 d, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C dlouhodobě.

ELISA je jednostupňový test založený na sendvičovém principu. Inaktivované HBsAg lidského původu obsahující subtypy ad a ay se používají k zakotvení v jamkách a také v konjugátu. Do jamek mikrotitračních destiček s navázaným HBsAg se pipetuje HBsAg s POD, přidají se standardy nebo vzorky a inkubuje se 60 min při 37 °C (Jiný postup je dvojstupňový. První reakce – 120 min – je navázání protilátky a po promytí se ve druhé reakci přidá konjugát a inkubuje 60 min).Po promytí 4x se přidá chromogen. Enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu s H₂O₂ modře (15 – 25 °C, 30 min ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,25 M H₂SO₄), který způsobí barevnou změnu na žlutou barvu. Intenzita zbarvení (450/615-690 nm) přímo úměrná koncentraci protilátek vůči HBsAg přítomných ve vzorku. Měření se provádí do 1 h. Kvalitativní hodnocení: absorbance průměru negativních kontrol + 0,08 je cut-off. Negativní výsledky na anti-HBs < cutoff, pozitivní ≥ cutoff. Kvantitativní hodnocení se provádí na základě měření 4 kalibrátorů v rozsahu 10 – 1000 U/l (vyšší koncentrace nutno ředit; linearita ředění 91 – 135 %). Preciznost v sérii je 3,2 – 7,7 %, mezi sériemi 3,2 – 12,7 %. Relativní senzitivita je 99,1 %, relativní specificita 99,8 %. Lipemické, hemolytické, ikterické vzorky a vzorky obsahující revmatoidní faktory neovlivní test.

Chemiluminiscenční analýza v dvojstupňovém sendvičovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené rekombinantním povrchovým antigenem viru hepatitidy B, na který se naváže anti-HBs ze vzorku. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá rekombinantní HBsAg značený akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HBs a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Rozsah kvantitativního stanovení na základě dvoubodové kalibrace je 10 – 1000 U/l (automatické ředění 25x, manuální 100x – ředění lze i kombinovat a měřit až do 2500000 U/l). Vzorky < 10 U/l jsou nereaktivní na anti-HBs, ≥ 10 U/l jsou reaktivní.  Preciznost v sérii je 1,9 – 6,5 %, mezi sériemi 3,0 – 8,6 %. Relativní senzitivita je 96,0 %, relativní specificita 99,2 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neinterferují.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se pipetuje rekombinantní HBsAg a latexové částice v TRIS pufru. Po inkubaci 2,75 min při 37 °C se přidají paramagnetické latexové částice potažené lidským HBsAg (subtypy ad a ay), který je značený esterem akridinu. Při další inkubaci (5,5 min při 37 °C) se na částice připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství anti-HBs) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace (v tripletu). Rozsah měřeni do 1000 U/l (pak ředění 2x, 5x, 10x). Vzorky s koncentrací anti-HBs < 8 U/l se považují za nereaktivní, 8 – 12 U/l jsou neurčité a > 12 U/l jsou reaktivní na anti-HBs. Preciznost v sérii je 1,6 – 4,0 %, mezi sériemi 2,0 – 5,7 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 99,8 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 15 %. Efekt nadbytku protilátek se neprojevuje až do 200000 U/l.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy anti-HBs ze vzorku se naváže během inkubace na rekombinantní povrchový antigen hepatitidy B a magnetické částice potažené lidským HBsAg (subtypy ad a ay), který je značený izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HBs. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku a umožňují rozsah měření 5 – 1000 U/l (možnost ředění 50x nebo 90x). Vzorky s koncentrací anti-HBs < 9 U/l se považují za nereaktivní, 9 – 11 U/l jsou neurčité a > 11 U/l jsou reaktivní na anti-HBs. Preciznost v sérii 1,9 – 6,3 %, mezi sériemi 2,4 – 11,5 %; linearita ředění 86 – 120 %. Relativní senzitivita je 96,6 %, relativní specificita 97,6 %. Ani koncentrace hemoglobinu 1 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Efekt nadbytku protilátek se neprojevuje až do 570000 U/l.

Jiné stanovení je založeno na dvoukrokové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HBs ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reagují s lidským HBsAg (subtypy ad a ay) imobilizovaným na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na jiný paratop anti-HBs naváže lidský HBsAg  (subtypy ad a ay) konjugovaný s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-HBs ve vyšetřovaném vzorku. Používají se dva kalibrátory umožňující měřit v rozsahu 3 – 2000 U/l. Analytická citlivost je ≤ 3 U/l. Vzorky < 10 U/l jsou nereaktivní na anti-HBs, ≥ 10 U/l jsou reaktivní.  Preciznost v sérii je 4,4 – 10,2 %, celková 5,0 – 10,9 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 99,7 %. Ani vysoké triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l neruší. Avšak hemolýza při stanovení ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v jednostupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené lidským HBsAg (subtypy ad a ay), standard nebo vzorek a lidský HBsAg (subtypy ad a ay) značený ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HBs. Doba analýzy je 55 min. Na základě pěti standardů (10, 20, 50, 250, 750 U/l) se vypočte kalibrační křivka 0 – 750 U/l. Koncentrace > 750 U/l lze ředit. Vzorky < 10 U/l jsou nereaktivní na anti-HBs, ≥ 10 U/l jsou reaktivní. Preciznost v sérii 2,1 – 3,7 %, mezi sériemi 3,5 – 4,5 %. Relativní senzitivita je 97,2 %, relativní specificita 97,4 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (513 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze. Efekt nadbytku protilátek se neprojevuje až do 58500 U/l.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy se anti-HBs ze vzorku váže na lidský HBsAg (subtypy ad a ay), kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky a lidský HBsAg (subtypy ad a ay) značený křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 45 min a první výsledek je k dispozici za 55 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci anti-HBs ve vzorku. Používají se tři kalibrátory (0, 30, 250 U/l) a rozsah měření je 4,23 – 1000 U/l (Limit blanku 3,08 U/l, detekční limit 4,23 U/l). Koncentrace > 1000 U/l se ředí 20x. Vzorky s koncentrací anti-HBs < 8 U/l se považují za nereaktivní, 8 – 12 U/l jsou neurčité a > 12 U/l jsou reaktivní na anti-HBs.  Preciznost v sérii 0,7 – 2,8 %, mezi sériemi je 2,5 – 4,8 %. Relativní senzitivita je 99,7 %, relativní specificita 100 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (40 µl) je inkubován s biotinylovaným lidským HBsAg (subtypy ad a ay) a lidským HBsAg (subtypy ad a ay) značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Provádí se dvoubodová kalibrace dovolující měření v rozsahu 2 – 1000 U/l (vyšší koncentrace lze ředit 100x ale koncentrace po ředění musí být > 10 U/l). Luminiscence je přímo úměrná hladině anti-HBs ve vzorku. Detekční limit je ≤ 2 U/l. Vzorky < 10 U/l jsou nereaktivní na anti-HBs, ≥ 10 U/l jsou reaktivní. Preciznost v sérii 1,1 – 6,6 %, mezi sériemi 3,4 – 16,2 %. Relativní senzitivita 97,5 %, relativní specificita je 99,8 %. Hemolýza (hemoglobin 15 g/l), chylozita (triacylglyceroly 17 mmol/l), ikterus (bilirubin 513 µmol/l) a RF (< 2100 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu. Efekt nadbytku protilátek lze pozorovat při 150000 U/l.

Mezinárodní standard: WHO Second International Standard for anti-hepatitis B surface antigen immunoglobulin, human (NIBSC code: 07/164, 2008).

Falešná pozitivita: v nepřítomnosti HBsAg stanovit anti-HBc, při transfúzi nebo u hemofiliků.