porphobilinogen, PBG

systematický název: 3-[5-(aminomethyl)-4-(karboxymethyl)-1H pyrrol-3-yl]propanová kyselina;

3-[5-(aminomethyl)-4-(carboxymethyl)-1H pyrrol-3-yl]propanoic acid

Stanovení se provádí v jednorázovém vzorku (ranní) moče, který chráníme před světlem v nádobě s přídavkem 0,3 % NaHCO₃ (pH 6 – 7) v chladničce. Stabilita v moči po úpravě pH a ve tmě 4 – 7 d při 15 – 25 °C, 7 – 14 d při 4 – 8 °C, 1 měsíc při -20 °C.

Watson-Schwartzův test kvalitativně prokazuje přítomnost PBG reakcí s Ehrlichovým činidlem. Vznik zbarvení není specifický a může být způsobený také urobilinogenem, indolem nebo indikanem. Pro zvýšení pH reakce se přidává octan sodný. Tím se maximalizuje vznik zbarvení urobilinogenem, které je rozpustné v chloroformu. Barevné produkty urobilinogenu a ostatních interferentů se extrahují do chloroformu. Pokud je zbarvená horní vodná vrstva, tak se jedná o PBG. Vodná vrstva se ještě může dále extrahovat butanolem, a pokud zůstává i nadále zbarvená, tak se určitě jedná o PBG.

Fotometrie: Hoeschův test nereaguje s urobilinogenem. Tento postup je jednodušší, protože nepoužívá při reakci s Ehrlichovým činidlem ani octan sodný, ani žádnou extrakci. Nicméně postup je nespecifický, protože pozitivní reakci poskytují indol, indol-3-octová kyselina, alfa-metyldopa, fenazopyridin hydrochlorid a konečné stádium alkoholické malnutrice. PBG obsažený v moči reaguje s Ehrlichovým činidlem v kyselém prostředí za vzniku růžovofialového zbarvení, jehož intenzita se stanoví fotometricky. 20x ředěná moč se měří při 552 nm proti reagenčnímu blanku. Na základě kalibrační přímky (jednobodová kalibrace) se získá výsledek (odečíst do 10 min). Červená sloučenina reaguje zvolna s další molekulou pyrrolu za vzniku bezbarvého dipyrrolfenylmetanu. Výsledky jsou v µmol/l (případně mg/l). Kalibrace 11 – 221 µmol/l, citlivost 0,9 µmol/l, mez detekce 3,5 µmol/l, mez stanovitelnosti 11 µmol/l. Preciznost v sérii 6,37 %, mezi sériemi 2,7 %. Rozšířená standardní nejistota je 11 %.

Iontově-výměnná chromatografie: Upravená moč (pH 8 – 10) se dávkuje na anexovou kolonu. PBG se adsorbuje na pryskyřici a interferující látky se vymyjí z kolony opakovaným promýváním vodou. PBG se vymyje 1 M CH₃COOH. PBG reaguje s Ehrlichovým činidlem (p-dimetylaminobenzaldehyd + 98 % CH₃COOH + 70 % HClO₄). Absorbance dosáhne maxima (při 555 nm) do 5 min, ale již po 20 min klesá o 10 %. Ionexové kolony jsou běžně dostupné. Jako náhradní kalibrátor místo PBG standardu lze použít metylenovou červeň.

Elektroforéza: PBG lze po elektroforéze eluovat a detekovat reakcí s Ehrlichovým činidlem. Metoda je málo citlivá a má jen historický význam.

HPLC: Pro separaci PBG od 5-aminolevulové kyseliny se používá kombinace kolony se silně anexovou a silně katexovou stacionární fází nebo jediná kolona s C18 reverzní fází. Systém s reverzní fází používá mobilní fázi obsahující 1-heptansulfonovou kyselinu jako párový ion v 95 % metanolu s vodou. Po separaci se PBG detekuje v eluátu při 240 nm UV detektorem. Analýza vzorku trvá < 15 min, nevyžaduje extrakci moče a provádí se přímý nástřik zředěné moče.

LC-MS/MS: Před chromatografii se provádí extrakce na pevné fázi, aby se odstranily složky moče, které potlačují signály iontů prekurzorů a produktů PBG. Retenční čas PBG byl 1 min, celková doba analýzy vzorku 2,3 min. Kolona LC18 33x4,3 mm, velikost zrna 3 µm. Mobilní fáze acetonitril-voda (3:7) s příměsí kyseliny mravenčí; průtok 1 ml/min. Jako vnitřní standard se používá 5-(aminoetyl)-4-(karboxymetyl)-1H-2,4-[¹³C]pyrrol-3-propanová kyselina. PBG a vnitřní standard byly monitorovány jako ionty prekurzorů a produktů pro PBG m/z 227 až 210 a pro vnitřní standard m/z 229 až 212 v pozitivním iontovém modu. K měření se používá trojitý kvadrupól s turbo-ionizačním sprejem (5800 V, kolizní plyn N₂ 0,06 kPa, kolizní energie 15 eV). Metoda vykazuje vyšší specifitu a citlivost, než ostatní metody; je lineární v rozsahu 0,44 – 8,8 µmol/l (nejvyšší standard 9,5 µmol/l) – měřeno do 20 µmol/l PBG. Preciznost v sérii byla 2,6 – 3,1 %, mezi sériemi 3,2 – 3,5 %; zpětný výtěžek 91,7 – 100 %.

Hodnoty snižuje: stání na světle při laboratorní teplotě, infúze glukózy, tioly, tryptofan; léky: askorutin, celaskon, cis-platina, lipovitan, erevit, vitamin E.

Hodnoty zvyšuje: olovo, nádory, acetylaceton, glycin, indolové deriváty, melanogeny (reagují s Ehrlichovým činidlem); léky: aminofenazon, anopyrin, barbituráty, danazol, dapson, difenylhydantoin, diklofenac, dirastan, fenobarbital, fenotiaziny (chlorpromazin, levopromazin, thioridazin), fenylbutazon, glutetimid, griseofulvin, chlorpropamid, karbamazepin, kyselina valproová, mefenytoin, meprobamat, noxyron, prokain, penicilin, pentazocin, perorální kontraceptiva, plegomazin, primidon, prokain, pyrazinamid, pyrazolon, radepur, rhytmochin, rudotel, seduxen, spasmoveralgin, sodanton, sulfonamidy, sulfonylurea, tetracyklin, tolazamid, tolbutamid, torecan, trimetadion.