Počet trombocytů, počet krevních destiček, platelet count, Plt

Pro vyšetření v rámci krevního obrazu se používá nesrážlivá krev s draselnými solemi kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA). Vyšetření se provádí jak z venózní, tak z kapilární nesrážlivé krve. Bezprostředně po odběru je nutné důkladné promíchání krve s antikoagulačním činidlem několikanásobným převrácením zkumavky. Transport materiálu nesmí být delší než 2h při 15 – 25 °C. Stabilita materiálu je 5 h při 15 – 25 °C. Nedodržení poměru s antikoagulačním činidlem může vést ke vzniku sraženiny, nebo k ovlivnění morfologie vysokou koncentrací solí.

V krajních případech lze jako antikoagulant použít i citrát nebo heparin, ale je nutné myslet na to, že může dojít k morfologickým změnám krevních elementů. U vyšetření z citrátové krve je nutné myslet na ředění vzorku (1:10) a tudíž připočítat 10 % naměřené koncentrace. Vzorky nechladit!

Počet trombocytů je obvykle součástí vyšetření krevního obrazu. Při práci je nutné myslet na to, že vyšetřovaný materiál je suspenze buněk a tudíž je nutná důkladná a opatrná homogenizace před vyšetřením (vyvarovat se prudkému míchání). Odebraný materiál se musí nechat ustálit 15 – 20 min. Je to doba nutná k vyrovnání koncentračních gradientů vně a uvnitř buněk (antikoagulační činidlo). Počítání trombocytů je možné mikroskopicky nebo na analyzátorech krevního obrazu.

Mikroskopické metody počítání trombocytů v krvi jsou přímé nebo nepřímé a jsou zatížené větší chybou. U nepřímé metody se odhaduje počet trombocytů z krevního nátěru. Zjistí se počet trombocytů na 1000 erytrocytů a výsledek přepočteme na počet erytrocytů v krvi. Při přímé metodě se vzorek krve naředí v přesně daném poměru s ředícím roztokem a po naplnění suspenze do speciální komůrky se trombocyty spočítají v přesně definovaném objemu pod mikroskopem. Zjištěný počet trombocytů se pak vynásobí ředícím koeficientem a přepočte na objem jednoho litru. Nejčastěji používaná komůrka je Bürkerova a jako ředící roztok se používá roztok oxalátu amonného, nebo nejčastěji prokainový roztok (metoda dle Piettových). Účelem ředícího roztoku je jak naředění vzorku krve, tak hemolýza erytrocytů. Manuální metoda s využitím fázového kontrastu patří k zlatému standardu, i když je zatížená větší chybou.

Moderní analyzátory pracují na dvou základních principech: impedančním nebo optickém. Impedanční detekce využívá konduktometrii. Měřící zařízení je složeno z dvojice nádob (vnitřní a vnější), které jsou propojeny malou štěrbinou (apertura) a naplněné nosným vodivým roztokem (diluent). Pomocí dvojice elektrod, na které je vloženo polarizované stejnosměrné elektrické pole, se sleduje vodivost mezi oběma nádobami. Naředěný vzorek se nechá pomocí tlaku přetékat z vnitřní nádoby do vnější, přes štěrbinu. Při vstupu elementu do štěrbiny dojde k nárůstu odporu a snížení napětí, které se měří pomocí voltmetru a zaznamená počítačem. Při přechodu přesného objemu štěrbinou se zjistí údaj o počtu elementů a z velikosti odporu se odvodí i jejich velikost. Nevýhodou této metody je, že zaznamená všechny mikročástice, které mohou ovlivnit měrný odpor prostředí, jako jsou prach, vzduchové bublinky, buněčné fragmenty apod.

Optická detekce využívá princip průtokové cytometrie. Po nasátí vzorku analyzátorem je ředěná suspenze buněk vháněná do průtokové cely, kde jsou elementy vystaveny úzkému paprsku světla, nejčastěji laseru. Buňky jsou v průtokové cele řazeny jednotlivě za sebou pomocí hydrodynamické fokusace. Element, který vstoupí do cesty paprsku světla, snižuje jeho optickou hustotu a způsobuje jeho rozptyl, který je detekován pod různými úhly. Detekce ve směru světelného paprsku poskytuje informace o počtu. Detekce v různých úhlech (rozptýlené světlo) poskytuje údaje o morfologii elementů. U některých analyzátorů je použité specifické barvivo, které má různou afinitu např. k RNA, myeloperoxidáze, apod., to poskytuje další údaj o morfologii analyzovaného elementu.

Nezávisle na principu se v jednom kroku při analýze počítají všechny elementy a to jak erytrocyty, tak trombocyty i leukocyty. Rozlišení trombocytů a erytrocytů je na základě velikosti. Software analyzátoru má nastavené limity objemů (při kterých se analyzované elementy zařazují do erytrocytů, nebo trombocytů) nebo se naměřené údaje matematicky analyzují a software vybere nejvhodnější oblast pro rozlišení erytrocytů a trombocytů. Způsob rozlišení je důležitý u nestandardních vzorků, např. při výrazné mikrocytóze, přítomnosti schistocytů, shluku trombocytů, nebo při makrotrombocytech. Nejvýhodnější je využití průtokové cytometrie s fluorescenčním barvivem, kdy kromě počtu a velikosti elementů lze rozlišit erytrocyty od trombocytů.

Při počítání elementů je možné odvodit i morfologické údaje. Počítač z jednotlivých naměřených údajů o velikosti trombocytů vyhodnotí:

Střední objem trombocytů – MPV, je udáván ve fl a vyjadřuje velikost trombocytů; distribuční šíři trombocytů – PDW, je udávána ve fl, % nebo jako bezrozměrné číslo v závislosti od výrobce analyzátoru a vypovídá o míře anizocytózy; destičkový hematokrit – PCT, je udáván v % nebo jako bezrozměrné číslo a udává objemový podíl trombocytů v celé krvi (Tento údaj není možné zjistit klasickou centrifugaci ve skleněné kapiláře). Měřicí rozsah analyzátorů je převážně 10 – 2000x10⁶/l, u vyšších hodnot je nutné vzorek naředit nosným roztokem (diluent) a naměřenou hodnotu vynásobit koeficientem ředění. Preciznost za podmínek reprodukovatelnosti se pohybuje u kvalitnějších analyzátorů do 4 %, nicméně je přípustná až 15%. Intraindividuální variabilita je 9,1 %.

Toleranční limit v EHK je 20 – 27 %.

Hodnoty snižuje: kapilární odběr (chyba až 30 %), u novorozenců, před menstruací, těhotenství (pokles zhruba 10%), alkoholizmus, sepse, hypersplenismus, po transfuzi, chronická onemocnění jater, hypertermie, v krvi žilní oproti arteriální, agregace destiček, částečná koagulace, EDTA indukovaná pseudotrombocytopenie (frekvence 0,1%), přítomnost velkých trombocytů, destičkový satelitismus, přítomnost chladových aglutininů; vliv léků: vysoké dávky antibiotik zvláště penicilinu, amidopyrin, analgetika, aspirin, barbituráty, kotrimoxazol, cytostatika, diklofenak, digitonin, ergotamin, estrogeny, fenylbutazon, heparin, chinin, chinidin, chloramfenikol, karbamazepin, indometacin, metyldopa, meprobamat, paracetamol, ristocetin, salicyláty, tetracyklin, preparáty zlata, vizmutu, rtuti.

Hodnoty zvyšuje: tělesné cvičení (až dvojnásobek), kouření, delší pobyt ve vyšší nadmořské výšce, abstinence alkoholu, hemolýza (fragmenty erytrocytů), chronická lymfatická leukemie (fragmenty lymfocytů), kryoglobulin, kryofibrinogen, mikrocytóza erytrocytů, po adrenalinu, po brčálových (vinca) alkaloidech, po trombocytárním koncentrátu.