konjugovaný bilirubin, conjugated bilirubin, bilirubin glukuronát (diglukuronát)

mono-beta-D-glukopyranuronosyl ester 2,17-diethenyl-1,10-19,22,23,24-hexahydro-3,7,13,18-tetramethyl-1,19-dioxo-21H-bilin-8,12-dipropanové kyseliny;

mono-beta-D-glucopyranuronosyl ester 2,17-diethenyl-1,10-19,22,23,24-hexahydro-3,7,13,18-tetramethyl-1,19-dioxo-21H-biline-8,12-dipropanoic acid; 

název IUPAC: (2S,3S,4S,5R,6R)-5-[3-[2-[[3-(2-carboxyethyl)-5-[(Z)-(3-ethenyl-4-methyl-5-oxopyrrol-2-ylidene)methyl]-4-methyl-1H-pyrrol-2-yl]methyl]-5-[(Z)-(4-ethenyl-3-methyl-5-oxopyrrol-2-ylidene)methyl]-4-methyl-1H-pyrrol-3-yl]propanoyloxy]-3,4,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid

Přímý bilirubin a direct bilirubin nejsou synonyma pro konjugovaný bilirubin, protože takto se stanovuje také δ-bilirubin a také malé množství nekonjugovaného bilirubinu.

Stanovení v séru se dává přednost.

Zabraňte hemolýze při odběru. Vzorky nutno chránit před teplem a světlem. Účinkem intenzivního slunečního záření dochází k poklesu koncentrace bilirubinu až o 30 – 50 % za 1 h.

Stabilita vzorku ve tmě: konjugovaný bilirubin sérum: 20 – 25 °C 1 den, 4 – 8 °C 5 – 7 dní, -20 °C 6 – 12 měsíců; pupečník: 2 - 8 °C 2 dny, -20 °C 14 týdnů; moč 2 h při 20 – 25 °C.

Sběr moči za 24 hodin je zejména v ambulantní praxi nejvíce chybami zatížený postup. Až u 35 - 50 % pacientů nebývá dosaženo spolehlivého sběru. Nejčastější chybou je subjektivní opomenutí pacienta sebrat veškerou moč (vymočení před defekací, nedodržení časových intervalů). Určitou kontrolou může být stanovení kreatininurie a srovnání s obvyklými hodnotami. V moči lze stanovit pouze konjugovaný bilirubin.

Konjugovaný bilirubin lze stanovit také v mozkomíšním moku.

Většina metod fotometrického stanovení konjugátů bilirubinu s kyselinou glukuronovou vychází z reakce s diazotovanou kyselinou sulfanilovou (diazotace). Stanovení dle Doumase-Perryho vychází z původní metody dle Jendrassika a Grófa. Produktem reakce je barevný azobilirubin, který je při slabě kyselém a neutrálním pH červený, v silně kyselém pH a v bazickém prostředí zelenomodrý. Metoda má výbornou výtěžnost a interferuje při ní pouze zinek. Bez akcelerátoru reaguje s diazo činidlem pouze konjugovaný bilirubin (rozpustný ve vodě) a δ-bilirubin (bilirubin kovalentně vázaný na albumin) tzv. přímý bilirubin. Produkt diazotace bez akcelerátoru se stanovuje po určité krátké době, která stačí k diazotaci přímých forem bilirubinu (~ 10 min), kdy se zastaví reakce kyselinou askorbovou (dojde k rozložení diazoniové soli potřebné pro kopulaci).

Enzymová metoda pro stanovení bilirubinu používá bilirubinoxidázu (EC 1.3.35) z Myrothecium verrucaria, která katalyzuje oxidaci bilirubinu na biliverdin, což se sleduje 5 min jako pokles absorbance při 405 – 460 nm. Konjugovaný bilirubin se stanovuje při pH 4,5. Preciznost metody v sérii je 0,58 – 5,0 %, mezi sériemi 1,61 – 7,14 %; zpětný výtěžek 96 – 101 %. Neruší kyselina askorbová, glutation, L-cystein, kyselina močová, močovina, kreatinin, glukóza, lipémie, antikoagulancia, hemoglobin a albumin. Reakce se může také provádět při pH 5,5 ve ftalátovém pufru s přídavkem askorbátoxidázy (oxidace interferujícího askorbátu ze séra) 5 min při 37 °C. S přídavkem N-acetylcysteinu a NaF lze za optimálních podmínek (pH 5,5) snížit reakci s nekonjugovaným bilirubinem na < 1 %.   

HPLC separuje metylestery konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu, které můžeme kvantifikovat. Postup může být v budoucnu referenční metodou.HPLC výsledky ukazují, že plazmě zdravých osob je < 5 % konjugovaného bilirubinu, ale většina diazo metod koncentraci této frakce značně nadhodnocuje. Navíc HPLC prokázala přítomnost nebilirubinových látek, které také poskytují diazo reakci. Některé sloučeniny, které jsou přítomné v moči jako mezobilifuscin a uroerytrin interferují při močové analýze a podobné látky lze přepokládat v plazmě. Množství stanoveného přímého bilirubinu závisí na délce reakce a teplotě měření. Mobilní fází je izopropylalkohol a fotometrická detekce probíhá při 450 nm (vnitřní standard riboflavin-5′-monosodiumfosfát).

Při použití vícevrstvého filmu se aplikuje Jendrassikova–Grófova reakce při stanovení celkového bilirubinu, který se váže na hydrofobní katex polyesterového filmu.  V důsledku toho vzniká spektrální posun a nekonjugovaný bilirubin má vyšší absorbanci při 460 nm než konjugovaný bilirubin. Proto se měří ještě při 400 nm a δ-bilirubin je pak rozdíl mezi celkovým bilirubinem a konjugovaným + nekonjugovaným bilirubinem. Vychýlení mezi metodou s vícevrstvým filmem a Jendrassik–Grófovou fotometrickou metodou ukazuje na schopnost suchého filmu rozlišit mezi δ-bilirubinem a glukuronidem bilirubinu. Bichromatické měření eliminuje vliv hemoglobinu a karotenů. Vícevrstvým filmem lze měřit i konjugovaný bilirubin separátně a tak rozlišit konjugovaný, nekonjugovaný a δ-bilirubin.

Proužky pro měření konjugovaného bilirubinu v moči používají obvykle diazoniové soli 2,4-dichloranilinu nebo 2,6-dichlorbenzen-diazonium fluoroborát, případně triazen. Kyselé prostředí vytváří katexová matrice. Ve všech metodách při stanovení v moči interferuje endogenní zbarvení moče.

Referenční (kontrolní) materiál nelze připravit z důvodů nestability konjugovaného bilirubinu v matrici s normálním pH a iontovou silou. Proto se nejčastěji používá moče pacientů s patologickými hodnotami bilirubinu, které jsou analyzovány různými typy proužků. Metoda pro kvantitativní stanovení bilirubinurie (analogicky se sérovým stanovením) není vypracována.

Koncentraci bilirubinu snižují: askorbová kyselina, askorutin, fenobarbital, fyziologický roztok – infuze, nitrity (moč), nutramin, parenterální výživa, oxidace (delší stání moče), vitamin C aj.

Koncentraci bilirubinu zvyšují: cvičení, acetaminofen, amikin, aminosalicylová kyselina, anabolické steroidy, azathioprin, biliverdin, B-komplex, cyklosporin, desurol, erytromycin, esterifikované estrogeny, etanol, fenazopyridin (moč), fenothiaziny, fruktóza infuze, gentamycin, glukóza infuze, hemoglobin, histidin, hladovění, chlorpromazin, inderal, indikan, indinavir, indometacin, interleukin-2, izoniazid, karoten, klindamycin, kodein, lipémie, MAO inhibitory, mefenytoin, metyldopa, 3,4-metylendioxymetamfetamin, nalidixová kyselina, nortriptylin, oleandomycin, orální kontraceptiva, penicilin, plegomazin, prokainamid, progesteron, propylthiouracyl, pyrazinamid, spasmoveralgin, sulfasalazin, sulfonamidy, superanabolon, tetracyklin, trimekryton, trimepranol, tyrosin, valproová kyselina, visken, viskenit, vitamin A, warfarin, xylitol aj.