L-tyroxin, thyroxin,
FT4

3,5,3´,5´-tetrajódtyronin

Při analýze se dává přednost séru. Krevní elementy je nutné odstranit co nejdříve po odběru. Doporučuje se transport krve do laboratoře do 6 h. Koncentrace fT4 se nemění ani po 7 dnech v séru za laboratorní teploty. Nicméně se doporučuje sérum skladovat při 4 °C, pokud se neanalyzuje do 24 h. Jestliže je doba mezi odběrem a analýzou delší než 6 dní, je třeba vzorek zamrazit na -20 °C nebo ještě nižší teplotu. Po rozmrazení je nutné vzorky jemně, ale dobře rozmíchat. Při intenzivním míchání může dojít k denaturaci bílkovin. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Nepoužívejte heparin a nestanovujte fT4 u pacientů léčených heparinem. Ruší také přídavek EDTA, citronanu nebo fluoridu. Jiný pramen připouští použití EDTA nebo heparinové plazmy a doporučuje odběr nalačno. Některé neizotopové imunometody neumožňují ředit vzorky při vysokých koncentracích fT4. Používání hemolytických a lipemických sér se nedoporučuje. Silikonované odběrové zkumavky mohou vadit u některých analytických postupů. V některých případech dochází k vazbě fT4 na separační gely.
Stabilita v séru: 20 - 25 °C: 8 h – 2 dny, 4 - 8 °C: 1 – 14 dní, -20 °C: 1 – 3 měsíce. Výsledky ovlivňuje věk. Biologický poločas v plazmě 5 – 8 dnů.

Koncentrace volné frakce je velmi nízká (pmol/l). Přibližně 0,03 % z 96 nmol/l T4 v plazmě je ve volné formě
(29 pmol/l). První postupy používaly nepřímého měření s využitím rovnovážné dialýzy nebo ultrafiltrace. Byly vyvinuty také metody využívající ke značení radionuklidy (³H, ¹³¹I, ¹²⁵I). V současnosti se téměř výhradně používají kompetitivní neizotopové metody, ačkoliv metody vyšší kvality používají v úvodní fázi rovnovážnou dialýzu nebo ultrafiltraci.
Rozhodující faktory při analýze fT4 jsou: inkubační teplota (vazba na TBG je při 37 °C a za laboratorní teploty odlišná), inkubační doba (musí být dostatečně dlouhá pro dosažení rovnováhy kompetitivní reakce), vliv iontů při vazbě fT4 na proteiny (chloridy a fosforečnany inhibují vazebnou schopnost a obdobně působí endogenní látky jako fenoly, volné mastné kyseliny, salicyláty, furosemid), ztráty fT4 (pohlcováním do buněk, nebo adsorpcí na skle) a ředění séra (součástí metody je ředění pufrem, kdy dochází ke zvýšení vazby fT4 na proteiny, např. při stonásobném ředění je úbytek fT4 2 %).

RIA je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu. Značkou je ¹²⁵I. Používaný postup je známý také pod označením SPALT (solid-phase antigen-linked technique), kdy je antigen vázaný na pevné fázi. Antigen ze vzorku soutěží s fT4 vázaným na pevné fázi o omezené množství vazebných míst monoklonální myší protilátky označené 125I. Protilátka váže < 1 % T4 vázaného na bílkovinu. Rozsah metody 1,7 – 126 pmol/l. Analytická citlivost (2 SD) je 1,67 pmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 3,6 – 4,2 %, mezi sériemi 3,4 – 4,8 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza na sendvičovém principu používá dvoustupňovou reakci. Vzorek je inkubován s oxidem chromičitým , který je potažený monoklonální protilátkou vůči T4 na kterou se váže fT4 ze vzorku. Po magnetické separaci se promytím odstraní ze vzorku vazebné bílkoviny pro T4 a přidá se konjugát T3-ALP, který reaguje s neobsazenými vazebnými místy protilátky na částicích CrO₂. Nenavázaný konjugát je odstraněn promytím. ALP defosforyluje syntetický flavinadenindinukleotid fosfát (FADP) na FAD. Ten se váže na apo d-aminokyselinovou oxidázu a přeměňuje ji na aktivní holo d-aminokyselinovou oxidázu, jež katalyzuje tvorbu peroxidu vodíku z d-prolinu a kyslíku. H₂O₂ v přítomnosti křenové peroxidázy převádí 3,5-dichlor-
2-hydroxybenzensulfonovou kyselinu a 4-aminoantipyrin na barevný produkt, který se měří bichromaticky při
510 nm proti 700 nm v kinetickém režimu. Barevná změna je nepřímo úměrná koncentraci fT4 ve vzorku. Rozsah měření 2,57 – 83,7 pmol/l. Vyšší koncentrace se neředí. Analytická citlivost je 2,57 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii 1,3 – 3,2 % (při koncentraci 6,18 pmol/l 13,1 %), celková reprodukovatelnost 3,1 – 6,5 % ( při koncentraci 6,18 pmol/l 20,6 %). Interference 342 µmol/l bilirubinu, 10 g/l hemoglobinu, resp.
5,65 mmol/l triacylglycerolů jsou < 10 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T4 je také v kompetitivním uspořádání a obvykle používá jako značku křenovou peroxidázu. Protilátka vůči T4 je zakotvená v jamkách mikrotitračních destiček. Po konkurenční imunoreakci T4 ze séra a konjugátu T4 s POD se jamky vymyjí a přidá se peroxid vodíku
a substrát tetrametylbenzidin. Barevná reakce se zastaví 1M HCl a absorbance se měří při 450 nm vertikálním fotometrem. Detekční limit metody (2 SD) je 0,65 pmol/l. Rozsah měření je do 95,2 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 3,25 – 10,98 %, mezi sériemi 6,01 – 10,81 %. Křížová reaktivita d-tyroxin 98 %,
l-trijódtyronin 3 %, d-trijódtyronin 1,5 %.
FIA používá latexové mikrokuličky (MEIA) potažené monoklonální protilátkou vůči fT4, značkou je ALP
a substrátem 4-metylumbelliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm (excitace při 365 nm). K izolaci latexových kuliček se používá frita ze skleněných vláken. Rozsah metody 5,15 – 77,2 pmol/l. Citlivost metody je 5,15 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,1 – 5,96 %, mezi sériemi 0 – 5,26 %, mezi dny 0 – 7,69 %
a celkově 3,63 – 9,99 %.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza (fluorometric enzyme immunoassay FEIA) je radiální rozdělovací technika, kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická vůči T4 je imobilizována na malé plošce filtračního papíru ze skleněných vláken. Jako marker slouží T4 značený ALP. T4 ze vzorku a konjugát ALP-T4 se nechají postupně reagovat s imobilizovanou protilátkou. Po inkubaci se provede promytí roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem vymyje volný T4 z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku a je měřena fluorimetrem. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 3 – 6,5 %, mezi sériemi 8 – 11 %.
Fluorescence rozložená v čase (DELFIA) je heterogenní sekvenční postup s použitím chelátů europia jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce probíhá v mikrotitračních destičkách. Monoklonální protilátka vůči T4 je zachycena pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny jamek. Po inkubaci a promytí se přidá vzorek a fT4 reaguje s paratopy specifické protilátky. Opět následuje inkubace a promytí a přidá se europiem značený T4, které obsadí zbylá vazebná místa na protilátce. Po promytí a přidání zesilovacího roztoku jsou ionty europia disociovány z vázané fáze a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná množství T4 ve vzorku. Rozsah metody 2 –
80 pmol/l. Analytická citlivost metody je 2,68 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 5,3 – 9,8 %, mezi sériemi 3,9 – 14,1 %.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je založena na rovnovážné imunochemické kompetitivní reakci s následnou detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. Volný tyroxin stanovovaný ve vzorku pacientského séra soutěží s přidaným fT4 značeným esterem akridinu o omezený počet vazebných míst na polyklonální králičí protilátce vůči fT4. Tato specifická protilátka je vázaná kovalentně na paramagnetických částicích niklu. Reakce probíhá 7,5 min při 37 °C. Po odstranění nemagnetického materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem při 400 nm. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci fT4 ve vyšetřovaném vzorku. Linearita metody: do 155 pmol/l, detekční limit: 1,3 pmol/l (2 SD), preciznost dosahuje v sérii CV: 2,22 – 4,69 %, v čase: 1,58 – 4,59 %.
Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) je dvoustupňová metoda. Během prvního kroku se přidá vzorek k paramagnetickým mikročásticím, které jsou potažené protilátkami vůči T4. fT4 přítomný
ve vzorku se naváže na protilátky na mikročásticích. Po promytí se během druhého kroku přidá konjugát T3
s akridinem. Do reakční směsi se poté přidají roztoky peroxidu vodíku a hydroxidu sodného. Výsledná chemiluminiscenční reakce je nepřímo úměrná koncentraci fT4 ve vzorku. Rozsah metody 5,15 – 77,2 pmol/l. Citlivost metody je 5,15 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,3 – 3,8 % a celkově 3,8 – 7,8 %.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní sekvenční imunochemické reakci. Pevnou fázi prezentují polystyrénové kuličky potažené myší monoklonální protilátkou specifickou vůči lidskému T4. Do reakční zkumavky s kuličkou se přidá vzorek séra a T4 konjugovaný s biotinem. Inkubace probíhá
30 min při 37 °C za protřepávání. Během této doby soutěží volný T4 ze vzorku s konjugovaným T4 o omezený počet vazebných míst protilátky na kuličce. Nenavázaný materiál se pak odstraní odstředěním a promytím. Do zkumavky se pak přidá ALP vázaná na streptavidin. Po další 30 minutové inkubaci se nenavázaný enzymový konjugát odstraní odstředěním a promytím.Přidá se substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který se hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se (po 5 minutové inkubaci při 37 °C s mícháním) detekuje luminometrem. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci volného T4 ve vyšetřovaném vzorku. Optimální koncentrace blokujících činidel brání biotinovanému T4 ve vazbě na endogenní bílkoviny (včetně albuminu), zatímco vazebné vlastnosti přirozeného T4 se nemění. Blokační činidla také minimalizují interference vznikající při abnormálních hladinách albuminu nebo volných mastných kyselin. Konjugát T4 s biotinem nemá měřitelnou vazebnou afinitu vůči TBG. Specifická protilátka váže T4 přibližně tak pevně jako albumin, takže nedochází k oddělení hormonu od tyreoidálních vazebných proteinů. Linearita metody: do 77,2 pmol/l, detekční limit: 2,32 pmol (2 SD), citlivost: 2,57 pmol
(CV ≤ 20 %), preciznost v sérii dosahuje CV < 7,6 %, v čase (při koncentraci 8,62 pmol/l) < 9,1 %.
Homogenní sekvenční chemiluminiscenční imunoanalýza (LOCI) je založena na sendvičovém principu. Dvě činidla jsou zakotvena na kuličkách a dále je v reakci použitý biotinylovaný fragment myší monoklonální protilátky vůči fT4. První kulička (Chemibeads) je potažena trijódtyroninem, který má slabší vazebné schopnosti než T4, a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá kulička (Sensibeads) je potažena streptavidinem
a obsahuje barvivo citlivé na světlo. Vzorek je inkubován s biotinylovanou protilátkou a na její volná místa se naváže T4. Pak se přidá první kulička s T3 a vznikne imunokomplex (obsadí se volné pozice), který po přidání druhé kuličky vytvoří sendvič se streptavidin-biotinovým můstkem. Ozářením imunokomplexu světlem 680 nm vzniká na fotocitlivém barvivu singletový kyslík, který difunduje do chemiluminiscenčního barviva a spouští chemiluminiscenční reakci. Generované světlo se měří při 612 nm a je nepřímo úměrné koncentraci fT4
ve vzorku. Rozsah metody 1,3 – 103 pmol/l. Analytická citlivost (2 SD) byla 12,3 pmol/l. Reprodukovatelnost
v sérii je CV 1,36 – 1,96 %, mezi sériemi 1,57 – 2,81 %.
Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje po imunoreakci na sekvenčním principu, kdy se vzorek inkubuje se specifickou protilátku, značenou ruthéniovým komplexem a pak se přidá s biotinem značený T4, který obsadí zbývající volná místa na specifické protilátce a současně se přidávají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace
a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Metoda je použitelná v rozsahu 0,3 – 100 pmol/l. Detekční limit je 0,3 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,4 – 2,9 %, mezi sériemi 2,6 – 6,6 %. Vzorky pro stanovení fT4 nesmí být ředěny, jelikož T4, přítomný v krvi, má volnou frakci a frakci vázanou na bílkoviny v rovnováze. Změna
v koncentraci vazebných proteinů by porušila tuto rovnováhu.

Plynová chromatografie s elektronovým záchytem používá po dialýze derivatizace a N,O-diheptafluorobutyryl-
metylesterové deriváty lze stanovit na koloně OV-17 při 300 °C s mezí detekce 0,2 pg. Jako vnitřní standard je 3,5-dijód-3´,5´-dibromthyronin. Chromatografii předchází purifikace ve fosfátovém pufru na katexu. Reprodukovatelnost dosahuje CV v sérii 1,6 %.

Rovnovážná dialýza spojená s izotopovým ředěním, LC a tandemovou MS byla navržena jako mezinárodní referenční metoda. Stanovení se provádí v dialyzátu. Další postup odpovídá stanovení celkového T4. Pro izotopovou diluci se používá jako vnitřní standard tyroxin-d₅, který je přidáván do séra.Po dialýze slouží jako mobilní fáze 0,1 % kyselina octová v acetonitrilu ve směsi s vodou pro pozitivní ionty 778 a 783, resp. 0,2 % hydroxid amonný v metanolu ve směsi s vodou pro negativní ionty 776 a 781. Na koloně C18 se ionty rozdělí. Reprodukovatelnost v sérii dosáhla 0,2 – 1,0 %. Detekční limit je 30 pg pro pozitivní a 20 pg pro negativní ionty.

Jako primární referenční materiál byl WG-STFT (Working Group for Standardization of Thyroid Function Tests IFCC) doporučený materiál s označením IRMM-468. Jedná se o čištěný tyroxin 98,6 %, certifikovaný MS
s rozšířenou nejistotou 0,7 %.

Na základě celkové biologické variace 15,4 % bylo navrženo, že vychýlení při měření fT4 by mělo být ≤ 4 %.
Toleranční limit EHK: 13 %.

Koncentrace fT4 je v séru snížena: antikonvulsiva, dirastan, fenobarbital, fenytoin, furosemid, hemodialýza,
IGF-1, karbamazepin, kontraceptiva, laktace (pokles až 16 %), lithium, peritoneální dialýza, sodanton, těhotenství, thyreotom, ztráty bílkovin, aj.
Koncentrace fT4 je v séru zvýšena: acetylsalicyláty, amiodaron, cvičení, erytropoetin, fenylbutazon, heparin, heroin, Intralipid, reverzní trijódtyronin (< 3,2 %), thyreoidin, D-trijódtyronin (< 2 %), D-tyroxin (+52 %), aj.