luteinizační hormon; Luveris;

interstitial cell-stimulating hormone, ICSH

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin) nebo moči (obvykle odpad za 24 h). Při použití EDTA jsou výsledky v plazmě vyšší! Stabilita analytu v séru 1 – 7 d při 20 – 25 °C, 2 – 14 d při 4 – 8 °C, 1 – 60 měsíců při -20 °C. Opakované rozmrazování se nedoporučuje. Sérum lze posílat poštou bez chlazení.

Vzorky moče by neměly obsahovat stabilizátory a doporučuje se uchování při -20 °C.

U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.

K dispozici jsou stanovení, která umožňují simultánně vyšetřit FSH a LH (s markery ⁵⁷Co-LH + ¹²⁵I-FSH nebo Eu³⁺-LH + Tb³⁺-FSH).

Koncentrace LH v séru se může změnit během 20 min až trojnásobně, proto se zejména v pediatrii dává přednost sběru moče za 3 h (výkyvy se vyrovnají) a 80násobnému zahuštění vzorku.

RIA v sekvenčním uspořádání, kdy v prvním kroku reaguje LH ze vzorku se specifickou protilátkou a v následné inkubaci se pak přidá LH značené ¹²⁵I, není již v komerční soupravě na trhu. I když se oba inkubační kroky podařilo výrazně zkrátit (30 + 60 min), je specifita reakce vzhledem k podobnosti gonadotropinů neuspokojivá (interference hCG je 10 – 25 %).  

IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním ředěného séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči LH a přidáním druhé protilátky vůči LH značené ¹²⁵I. Po inkubaci (90 min, laboratorní teplota, třepání; nebo 2 h) se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,2 – 180 U/l (při vyšších hodnotách se provádí ředění nulovým kalibrátorem); analytická citlivost 0,2 U/l, funkční citlivost 0,4 U/l. Preciznost v sérii je ≤ 6,7 %, mezi sériemi ≤ 3,7 %. Linearita ředění 83 – 113 %, zpětný výtěžek 100 – 126 %. Interference hCG je < 0,008 %.

ELISA používá dvou protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou (může být kozí polyklonální) a druhá (myší monoklonální) má biotinylovou kotvu. Mikrotitrační jamky jsou potaženy streptavidinem (v některých soupravách je monoklonální protilátka zakotvena přímo v jamkách). Po inkubaci 1 h (nebo 45 min) a dvojnásobném (nebo 5x) propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (0,15 M H₂SO₄) a měří se při 450 nm (obvykle do 15 min), kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci LH. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,5 – 200 U/l (některé soupravy jen do 50 U/l, jiné až do 240 U/l). Mez detekce je 0,5 U/l. Preciznost v sérii je ≤ 9,21 %, mezi sériemi ≤ 7,91. Zpětný výtěžek 90 – 104 %, linearita ředění 86 – 109 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 2500 U/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči β-LH. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí polyklonální protilátka vůči α-LH značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,5 – 250 U/l. (Vzorky s hodnotami LH > 250 U/l lze manuálně ředit 2x – hodnota po ředění musí být > 5 U/l). Preciznost v sérii je 3,85 – 6,33 %, celková preciznost metody je 4,42 – 8,49 %. Zpětný výtěžek 92 – 105 %. Analytická senzitivita je 0,5 U/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita TSH 3,5 %, ostatní ≤ 0,2 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Měřený signál je přímo úměrný hladině LH. Souprava už není na trhu.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena protilátka vůči LH. V sendvičovém uspořádání se pipetuje LH ze vzorku a specifická protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci a promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci LH ve vzorku a měří se do 1 h. Mez detekce metody je 0,05 U/l. Rozsah metody 0,05 – 250 U/l. Preciznost v sérii > 10 % (při koncentracích < 1,5 U/l) a < 7% (při koncentracích ≥ 1,5 U/l), mezi sériemi ~9,3 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči β-LH zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči α-LH značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině LH a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,5 – 250 U/l (Vzorky s hodnotami LH > 250 U/l lze automaticky nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být hodnota > 2 U/l). Preciznost v sérii je 1,7 – 3,6 %, celkově 2,4 – 8,9 %. Zpětný výtěžek 86,5 – 116,2 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,03 U /l, funkční senzitivita 0,09 U/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči LH značená esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá a monoklonální myší protilátka vůči LH kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 0,07 – 200 U/l. Vzorky s hladinou LH > 200 U/l se ředí 2x automaticky nebo manuálně jsou-li hodnoty > 400 U/l. Analytická citlivost je 0,07 U/l. Preciznost v sérii 2,3 – 3,0 %, mezi sériemi 1,5 – 2,9 %. Linearita ředění je 80,3 – 100,4 %, zpětný výtěžek 97,3 – 115,8 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Efekt nadbytku antigenu se při měření může projevit kolem 18000 U/l.

CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže LH a současně se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině LH. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,2 – 250 U/l. Analytická citlivost je 0,2 U/l, funkční citlivost 0,4 U/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 80000 U/l. Preciznost v sérii je 1,5 – 6,8 %, mezi sériemi 2,2 – 9,0 %. Linearita ředění je 100 – 103 %, zpětný výtěžek 96 – 104 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. LH se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči LH imobilizovanou na polystyrénové kuličce a současně se na druhé vazebné místo LH naváže polyklonální kozí protilátka vůči LH konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině LH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 200 U/l, avšak do hodnoty 85000 U/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 0,05 U/l. Preciznost v sérii 3,4 – 13,1 %, celková 6,1 – 26,3 %; zpětný výtěžek 98 – 113 %, linearita ředění 75 – 108 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující LH a paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší protilátkou vůči LH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči LH značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství LH. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 250 U/l. (po ředění 2x až do 500 U/l). Analytická citlivost 0,2 U/l. Preciznost v sérii je 3,8 – 5,4 %, celková 4,3 – 6,4 %. Linearita ředění 96,9 – 107,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy LH ze vzorku se váže současně na ovčí biotinylovanou protilátku vůči LH a myší monoklonální protilátka vůči beta-podjednotce LH značenou křenovou peroxidázou. Imunokomplex se zakotví v jamce potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min, 37 °C, třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě šestibodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci LH ve vzorku a odečítá se mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 0,216 – 200 U/l (ředění vyšších hodnot pouze manuálně). Analytická senzitivita 0,0367 U/l, funkční senzitivita 0,216 U/l. Preciznost v sérii 1,0 – 8,8 %, mezi sériemi je 1,5 – 11,3 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 5000 U/l. Hladiny biotinu zůstávají zvýšené do 24 h od podání.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči LH. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči LH a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-LH-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný hladině LH ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je 0,2 – 150 U/l (ředění se nedoporučuje). Analytická citlivost je 0,1 U/l, funkční citlivost je 0,2 U/l. Preciznost v sérii 1,2 – 2,4 %, mezi sériemi 1,8 – 3,0 %. Zpětný výtěžek je 99,2 – 105,5 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 U/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči LH značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči LH. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině LH ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,1 – 200 U/l. Ředění není nutné. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 0,6 – 1,8 %, mezi sériemi 1,6 – 5,2 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1150 U/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Referenční materiál nese označení WHO 2nd IS 80/552.

Toleranční limit EHK: 15 %.

Hodnoty snižuje: tělesné cvičení, hladovění, obezita, vegetariánství, stres, sálající teplo, kouření, pooperační stavy, slepota, dopamin, marihuana, práce s olovem, transplantace ledvin.

Hodnoty zvyšuje: chronický alkoholismus, dioxin, věk > 65 let, menopauza, bolesti hlavy, puberta, sezónní výkyvy světla.

V moči hodnoty zvyšují hladovění, ovulace a vegetariánství.

Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost heterofilních protilátek.