Stanovení se provádí v séru, případně v plazmě (antikoagulant EDTA, heparin nebo citronan). Dává se přednost vyšetření nalačno.
Stabilita vzorku: 20 - 25 °C: 3 h plazma, 24 h sérum; 2 - 8 °C: 14 dní plazma, 8 h – 14 dní sérum; 20 °C: 1 měsíc plazma, 2 – 4 měsíce sérum, při -70 °C i déle. Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 3 h při doporučené teplotě 20°C. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Volný PSA je směsí několika izoforem PSA. Biologický poločas volného PSA je necelé 2 h. Výsledky ovlivňuje věk a cirkadiánní rytmy.
Typické pro stanovení fPSA jsou neizotopové imunoanalýzy na principu EIA, FIA a LIA. Většina dostupných metod je obtížně navzájem porovnatelná, protože jejich výsledky závisí na použitých standardech, specifitě protilátek a čistotě antigenů, použitých pro výrobu protilátek.
ELISA používá mikrotitrační jamky potažené monoklonální protilátkou vůči fPSA. Po přidání vzorku se pipetuje druhá monoklonální protilátka vůči fPSA, značená křenovou peroxidázou a tetrametylbenzidin jako substrát. Reakce probíhá v kyselém prostředí a měří se absorbance při 450 nm. Citlivost metody je 0,1 µg/l. Imunoreakce mezi fPSA a oběma protilátkami může proběhnout volně v jamce, je-li jamka potažena streptavidinem a první protilátka je biotinylovaná. Preciznost této metody v sérii je CV 7,8 – 9,3 %, mezi sériemi 5,2 – 11,3 %.
Další enzymová imunoanalýza na sendvičovém principu používá jednokrokovou reakci, kdy je vzorek inkubován s oxidem chromičitým a konjugátem ß-galaktosidázy, které jsou potažené monoklonální protilátkou rozeznávající různé epitopy na fPSA. Nenavázaný konjugát je odstraněn magnetickou separací. Sendvič oxid chromičitý-Ab1-fPSA-Ab2- β-galaktosidáza s β-d-galaktopyranosidem chlorfenolové červeně. Hydrolýzou se uvolňuje chlorfenolová červeň a barevná změna při 577 nm je přímo úměrná koncentraci PSA ve vzorku. Lze měřit i bichromaticky s druhou vlnovou délkou 700 nm. Rozsah měření 0,06 – 45 µg/l (vyšší koncentrace nutno ředit). Povolená chyba metody CV 6,75 – 7,0 %. Reprodukovatelnost v sérii 1,5 – 3,7 % (9,6 % při koncentraci 0,07 µg/l), celková reprodukovatelnost 2,3 – 4,8 % (15,7 % při koncentraci 0,07 µg/l),. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l. Výtěžnost metody je průměrně 100 – 104 %. Analytická citlivost je 0,05 µg/l, detekční limit 0,06 µg/l.
Technologie IRMA používá dvě myší monoklonální protilátky proti odlišným epitopům molekuly fPSA. Značkou je 125I. Reprodukovatelnost metody je při výsledcích > 0,5 µg/l v sérii CV 12,3 – 19,1 %, mezi laboratořemi
18,1 – 26,0 %.
FIA používá magnetické nebo latexové mikrokuličky potažené monoklonální protilátkou vůči fPSA, značkou je ALP a substrátem 4-metylumbelliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm (excitace při 365 nm).
V případě použití magnetických mikrokuliček je detekční limit 0,01 µg/l. Metoda je použitelná od 0,01 do
100 µg/l fPSA. Reprodukovatelnost v sérii CV 2,85 – 3,02 %, mezi sériemi 2,69- 3,32 %; výtěžnost 97,0 –
103,6 %. Interference < 10 % je v případě hemoglobinu do 4,45g/l, volného bilirubinu do 273,6 µmol/l, triacylglycerolů do 11,3 mmol/l, kyseliny askorbové do 1135,6 µmol/l, lidský albumin do 50 g/l a heparinu do 100 kU/l.
V případě latexových kuliček se používá k jejich izolaci frita ze skleněných vláken.Celková preciznost má CV
4,0 – 4,1 %. Citlivost metody je 0,02 µg/l.
DELFIA technologie používá dvě protilátky. Kotvící monoklonální protilátka je vůči celkovému PSA a druhá monoklonální protilátka značená Eu3+ je vůči volnému PSA. Detekční limit je 0,004 µg/l. Reprodukovatelnost
v sérii má CV 1,5 – 3,3 %, mezi sériemi 2,3 – 4,1 %; výtěžnost 80,6 – 106,5 %.
Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči celkovému PSA značenou esterem akridinu a druhou myší monoklonální biotinylovanou protilátku vůči volnému PSA, která je ukotvena na paramagnetických částicích potažených streptavidinem. Luminiscence je nastartována alkalickým peroxidem vodíku a měří se při 400 nm. Metoda je použitelná bez ředění do 25 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se projevuje při koncentraci 10000 µg/l. Funkční citlivost je 0,01 µg/l; výtěžnost 90,9 – 114,7 %. Preciznost v sérii CV 2,0 – 5,3 %, mezi sériemi 0,8 – 5,2 %, celkem 3,5 – 7,9 %. Interference
s metodou jsou < 5 % při koncentracích hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu
427,5 µmol/l.
Jestliže podobná imunoreakce probíhá na latexových kuličkách (CMIA) je detekční limit 0,008 µg/l. Celková preciznost CV 6,2 – 9,2 %.
LOCI technologie (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) je homogenní sendvičová chemiluminiscenční imunoanalýza. První činidlo obsahuje latexovou kuličku potaženou monoklonální protilátkou proti celkovému PSA + chemiluminiscenčním barvivem a také volný fragment F(ab´)2 monoklonální protilátky vůči volnému PSA s biotinovou kotvou. Druhé činidlo obsahuje jinou latexovou kuličku potaženou streptavidinem a fotosenzitivní barvivo. Vzorek se inkubuje s prvním činidlem a na kuličku s monoklonální protilátkou vůči tPSA se naváže antigen tPSA a na něj druhá protilátka vůči fPSA s volnou biotinylovou kotvou (vytvoří se sendvič). Pak se přidá druhé činidlo a vytvoří se můstek streptavidin-biotin. Při iluminaci zářením
680 nm se z fotosenzitivního barviva druhé kuličky uvolní kyslík ve formě radikálu a difunduje do chemiluminiscenčního barviva první kuličky, kde vyvolá emisi světla 612 nm, která je přímo úměrná koncentraci fPSA ve vzorku. Analytická citlivost je 0,005 µg/l, detekční limit 0,015 µg/l, funkční citlivost 0,030 µg/l. Opakovatelnost metody má CV 1,25 – 1,64 %, reprodukovatelnost mezi laboratořemi 2,32 – 3,78 %; výtěžnost 96 – 104 %. Vychýlení vlivem hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) bylo
< 10 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 50000 µg/l.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na sendvičové imunochemické reakci. fPSA se
v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop fPSA s polyklonální králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem
s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci fPSA ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 25 µg/l. Detekční limit: 0,02 µg/l (2 SD), citlivost: 0,02 µg/l (CV ≤ 20 %). Reprodukovatelnost v sérii má CV < 5,6 %, mezi sériemi < 6,2 %; výtěžnost: 84 - 110 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l.
ALP může reagovat i s jiným luminiscenčním činidlem, např. Lumi-Phos 530. Detekční limit je 0,005 µg/l. Metoda je použitelná do 20 µg/l fPSA. Celková preciznost CV 2,5 – 6,0 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 20000 µg/l.
Elektrochemiluminiscence následuje po imunoreakci na sendvičovém principu, kdy se vzorek inkubuje
s biotinylovanou monoklonální protilátkou, specifickou vůči fPSA a monoklonální protilátkou, specifickou vůči fPSA značenou ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Metoda je použitelná
v rozsahu 0,01 – 50 µg/l. Detekční limit je 0,01 µg/l, funkční citlivost 0,02 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV
1,0 – 2,8 %, mezi sériemi 3,4 – 5,5 %. Stanovení není ovlivněno bilirubinem < 1 112 μmol/l, hemoglobinem
< 15 g/l, lipémií < 15 g/l a biotinem < 123 nmol/l.
V roce 2000 byl představen WHO a NCCLS referenční standard obsahující 100 % volného PSA s kódem 96/686.
Data z USA 2005 uvádějí analytickou preciznost 7,2 % (DELFIA) a biologickou variaci 7,5 – 9,7 %.
Toleranční limit EHK: 16 %.
Přítomnost heterofilních protilátek nebo nespecifických vazeb může zapříčinit jak falešně nižší, tak falešně vyšší výsledky.
Koncentrace fPSA je zvýšena: masáž prostaty, obstrukce moče, ultrazvuk prostaty, tělesná zátěž (zejména jízda na kole), při zácpě.
