anti-EBV-CA, anti-VCA; anti-HHV-4 (CA), antibodies against human herpes virus 4

CA = capsid antigen (skořápkový)

Poznámka: nesprávně je Epstein-Barrové virus VCA, protože V ve zkratce znamená virus

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA). Stabilita v séru při 15 – 25 °C 4 – 24 h (3 d), při 4 – 8 °C 7 – 14 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců.

ELISA metoda slouží pro kvantitativní/kvalitativní stanovení specifických IgM protilátek vůči skořápkovému antigenu viru Epstein-Barrové (syntetický peptid VCA p18). Jamky mikrotitračních destiček jsou potaženy myší IgG monoklonální protilátkou vůči lidskému IgM. Po přidání vzorku nebo kalibrátoru se na zakotvenou protilátku naváže IgM protilátka vůči VCA p18 (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) se, díky IgM protilátkám vůči VCA p18 přítomným ve vyšetřovaném séru, syntetický peptid VCA p18 a konjugát (krysí monoklonální IgG protilátka vůči VCA p18 spojená s křenovou peroxidázou) naváží na pevnou fázi (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) je enzymová aktivita po reakci s tetrametylbenzidinem a H₂O₂ (30 min, laboratorní teplota, ve tmě) úměrná koncentraci IgM protilátek vůči VCA p18 ve vzorcích nebo v kalibrátorech. Výsledná intenzita zbarvení jamek se měří po přidání stop činidla (0,8 M H₂SO₄) do 60 min fotometrem při 450/630 nm nebo 405/630 nm a na základě čtyřbodové kalibrace je úměrná množství protilátek ve vzorku. Rozsah měření 5 – 140 kU/l. Preciznost v sérii 3,4 – 16,6 %, mezi sériemi 4,5 – 14,6 %; linearita ředění 98,0 – 103,5. Citlivost je 96,0 %, specifita 98,0 %. Lipemické (do 11,3 mmol/l triacylglycerolů), hemolytické (do 2,5 g/l hemoglobinu) a ikterické vzorky (do 513 µmol/l bilirubinu) neovlivňují výsledek testu.

Chemiluminiscenční kvalitativní analýza v sendvičovém uspořádání používá antigen VCA zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá rekombinantní myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgM značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-EBV-CA IgM a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě jednobodové kalibrace v tripletu (vzorky nelze ředit). Přítomnost nebo absence protilátek vůči EBV-CA třídy IgM ve vzorku se určuje na základě porovnání hodnoty chemiluminiscenčního signálu v reakci s hodnotou cut-off, která je určena z kalibrační křivky. Je-li chemiluminiscenční signál vzorku vyšší nebo roven hodnotě cut-off, je vzorek považován za reaktivní na protilátky vůči EBV-CA třídy IgM. Preciznost v sérii je 1,9 – 2,2 %, celkově 2,1 – 2,4 %. Relativní senzitivita je 96,1 %, relativní specificita 98,7 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze in vitro.

CLIA (nepřímá chemiluminiscenční analýza) je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené syntetickým peptidem VCA p18 naváží během první inkubace (10 min) protilátky vůči VCA ze vzorku. Po promytí se na jejich další epitop připojí během druhé inkubace (10 min) monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgM značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině IgM protilátek vůči EBV-CA. Rozsah měření je na základě dvoubodové rekalibrace vzorové křivky (zadané čárovým kódem) 10 – 160 kU/l (při vyšších hodnotách ředit diluentem 10x). Analytická citlivost je 10 kU/l. Preciznost v sérii 5,4 – 7,9 %, mezi sériemi 5,8 – 11,1 %. Linearita ředění je 88 – 112 %. Relativní senzitivita je 97,8 %, relativní specificita 99,2 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Polystyrenová kulička je potažená monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM. Během inkubace se IgM protilátky vůči EBV-CA váží na polystyrenové kuličky. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se ve druhém kroku biotinylovaný VCA peptid spojuje s konjugátem streptavidin-ALP a připojuje se na anti-EBV-CA. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-EBV-CA IgM ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor anti-EBV-CA IgM (vzorky lze dle potřeby ředit manuálně). Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 5,3 – 11,7 %, mezi sériemi 6,5 – 14,7 %. Relativní senzitivita je 89,4 %, relativní specificita 96,4 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 2,7 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky reagující s imunoglobuliny mohou způsobit interference in vitro.

Falešně negativní hodnoty: u dětí předškolního věku, u imunodeficitních pacientů.

Falešně pozitivní hodnoty: křížová aktivita jiných herpetických virů, polyklonální aktivace B lymfocytů u imunopatologických stavů (mononukleóza).