pregnancy-associated plasma protein A

Stabilita v séru 8 h při laboratorní teplotě, 24 h – 72 h při 4 – 8 °C, 3 – 12 měsíců při -20 °C. Nedoporučuje se používat plazmu.

IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním ředěného séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči PAPP-A a přidáním druhé protilátky vůči PAPP-A značené ¹²⁵I. Po inkubaci (90 min, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 2,6 – 10000 mU/l (vyšší koncentrace se ředí mužským sérem nebo sérem netěhotných žen), analytická citlivost 2,6 mU/l, funkční citlivost 18 mU/l. Preciznost v sérii je < 4,1 %, mezi sériemi < 6,0 %; zpětný výtěžek 80,8 – 113 %, linearita ředění 81,9 – 111 %. Při měření mohou interferovat heterofilní protilátky.

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou protilátkou vůči PAPP-A (některé testy používají destičku potaženou streptavidinem a Ab se zakotví až během testu). Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek. Po inkubaci (120 min, laboratorní teplota) se odsaje roztok, jamky se 5x promyjí a přidá se druhá protilátka vůči PAPP-A označená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (60 min, laboratorní teplota) se odsaje roztok, jamky se 5x promyjí. Pak se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂ (inkubace 8 – 12 min ve tmě, laboratorní teplota) a následně stop činidlo (0,2 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450/630 nm do 30 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 0,18 – 50 mU/l (některé soupravy 100 mU/l). Analytická citlivost je 0,18 mU/l (některé soupravy 0,005 mU/l). Preciznost v sérii je 3,6 – 8,5 %, mezi sériemi 4,2 – 5,6 %; zpětný výtěžek 83 – 100 %, linearita ředění 89 – 109 %. Hemoglobin 2 g/l, triacylglyceroly 11,3 mmol/l a bilirubin 684 µmol/l neruší. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1000 mU/l. Při měření mohou interferovat heterofilní protilátky.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi PAPP-A ze vzorku, myší monoklonální protilátkou vůči PAPP-A značenou Eu³⁺ a myší monoklonální protilátkou vůči PAPP-A, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k PAPP-A) přímo úměrný hladině PAPP-A. Rozsah měření je 4 – 6000 mU/l (po automatickém ředění až do 90000 mU/l). Kalibrace je pouze jednobodová. Analytická citlivost je 4 mU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 10 mU/l. Preciznost v sérii 2 – 23 %, mezi sériemi 3 – 24 %. Linearita ředění je 90 – 110 %.  Neruší hemoglobin < 2,5 g/l, triacylglyceroly < 10,2 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 90000 mU/l.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Mikrotitrační destičky jsou potaženy protilátkou vůči PAPP-A. Po pipetování vzorku se přidají protilátky vůči PAPP-A značené Eu³⁺. Po inkubaci (20 min, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů ve vzorku a měří se do 1 h. Rozsah měření 50 – 10000 mU/l, při inkubaci 2 h: 10 – 2000 mU/l. Analytická senzitivita < 5 – 10 mU/l.

CLIA stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. PAPP-A se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči PAPP-A imobilizovanou na polystyrénové kuličce a na druhé vazebné místo PAPP-A naváže monoklonální myší protilátka vůči PAPP-A konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci PAPP-A ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 10000 mU/l, avšak do hodnoty 115000 mU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Analytická citlivost je 25 mU/l. Preciznost v sérii 2,8 – 4,0 %, celková 3,5 – 12 %; zpětný výtěžek 96 – 138 %, linearita ředění 88 – 109 %. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l), hemoglobin (< 1,57 g/l), triacylglyceroly (< 33,9 mmol/l). Při měření mohou interferovat heterofilní protilátky.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující PAPP-A, paramagnetické částice potažené monoklonální myší protilátkou vůči PAPP-A a druhá monoklonální myší protilátkou vůči PAPP-A značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství PAPP-A. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 1111 mU/l. (po ředění automaticky 2x do 2222 mU/l, nebo manuálně 10x až do 11110 mU/l). Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 111000 mU/l. Křížová reakce: prekurzor eozinofilního hlavního základního proteinu (ProMBP) -4,5 %. Při měření mohou interferovat heterofilní protilátky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči PAPP-A značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči PAPP-A. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině PAPP-A ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 4 – 10000 mU/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x s měření do 100000 mU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 4 mU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 20 mU/l. Preciznost v sérii 1,1 – 2,4 %, mezi sériemi 1,1 – 2,8 %. Hemoglobin 10 g/l, triacylglyceroly 17 mmol/l, bilirubin 205 µmol/l a RF (< 1000 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 120000 mU/l.

Mezinárodní standard WHO IRP 78/610.

Toleranční limit EHK: 18 %.

V dostupné literatuře nejsou uvedené.