Calcitonin, Calciben, Calcimar, Salmotonin, Thyrocalcitonin

Vzorek do laboratoře transportovat na ledu (vodný odběr do zkumavky s aprotininem 400 kU/l na 1 ml vzorku). Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparin, odběr do EDTA snižuje výsledky). Hladiny v séru jsou nižší než v plazmě. Krev je třeba zpracovat ihned, sérum nebo plazmu použít do 2 h, při 2 – 8 °C lze skladovat 19 – 24 h, nebo zamrazit (při -20 °C lze skladovat 15 – 90 d. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Je třeba vyloučit hemolýzu. Projevuje se diurnální variabilita s vrcholem mezi 24. a 2. h.

Při stimulaci pentagastrinem 0,5 µg/kg hmotnosti se odběr provádí před podáním a 2 – 5 min po podání.

Stanovení lze provádět také v kultivačních médiích, tkáňovém homogenátu, likvoru nebo moči.

RIA začíná pipetování vzorku a králičího antiséra vůči kalcitoninu. Dále se přidá kalcitonin značený ¹²⁵I. RIA stanovení probíhá v jednom kroku. Zkumavky se nechají inkubovat při 4 °C 18 – 24 h. Po inkubaci se přidá kozí protilátka vůči králičímu IgG a králičí sérum. Proběhne další inkubace 90 min za laboratorní teploty. Následně se přidá pufr a roztok se odstředí (chlazená centrifuga 20 min) a opatrně odsaje. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace kalcitoninu v kalibrátorech a vzorcích je nepřímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení osmi sérových kalibrátorů a hodnoty kalcitoninu přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah měření 10 – 1280 ng/l.

IRMA používá myší monoklonální protilátku vůči regionu AA 11 – 17 kalcitoninu vázanou na stěnu zkumavky, na kterou se váže kalcitonin ze vzorku a pak na něj myší monoklonální protilátka vůči regionu AA 23 – 32 kalcitoninu značená ¹²⁵I. Imunoradiometrické stanovení kalcitoninu (vytvoření sendviče) probíhá v jednom kroku. Zkumavky se nechají inkubovat 20 – 24 h při 18 – 25 °C. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a dvakrát propláchne a odsaje. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace kalcitoninu v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Rozsah stanovení je 1,5 – 1500 ng/l. Analytická citlivost je 1,5 ng/l, funkční citlivost 4 ng/l.

ELISA je založena na kompetitivním principu, kdy se na kotvící protilátku s blokovanými nespecifickými vazebnými místy (vázanou na mikrotitrační destičce) připojí Fc fragment králičího IgG vůči kalcitoninu. O jeho Fab fragment pak soutěží kalcitonin ze vzorku a biotinylovaný kalcitonin (120 min třepání). Po čtyřnásobném promytí se přidá streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou (60 min třepání). Po čtyřnásobném promytí se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna reakce s peroxidázou (60 min třepání) se sleduje po zastavení stop činidlem (např. 2 M HCl) a protřepání fotometricky do 20 min při 450 nm. Analýza probíhá při laboratorní teplotě. Mez detekce je 0,1 µg/l. Rozsah měření je na základě pětibodové kalibrace 0,01 – 1000 ng/l. Signál je nepřímo úměrný koncentraci kalcitoninu ve vzorku.

Jiná souprava ELISA na sendvičovém principu používá kotvící monoklonální myší protilátku vůči kalcitoninu a konjugát monoklonální myší protilátky vůči kalcitoninu s peroxidázou. Inkubace probíhá 18 h při 2 – 8 °C. Další postup je podobný jako v předchozí analýze. Mez detekce je 0,7 ng/l s rozsahem 0,7 – 400 ng/l. Tak nízké hodnoty ale není třeba v lidském séru stanovovat. Preciznost v sérii byla 1,7 – 3,9 %, mezi sériemi 4,9 – 6,0 %; zpětný výtěžek 99 – 105 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 480000 ng/l. Stanovení ruší hemolytické a lipemické vzorky.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Mikrotitrační destičky jsou potaženy protilátkou vůči kalcitoninu. Po pipetování vzorku se inkubuje přes noc při 4 °C, pak se jamky 3x promyjí a přidá se protilátka vůči kalcitoninu značená Eu³⁺. Po inkubaci (2 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí 6x, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm) je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 3,9 – 128 ng/l kalcitoninu (vyšší koncentrace lze naředit). Analytická senzitivita je 3,9 ng/l. Preciznost v sérii 11 %, mezi sériemi 5 – 15 %; zpětný výtěžek 85 – 103 %.

Dvojstupňový zábleskový postup CLIA, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během inkubace (10 min) kalcitonin a na jeho další epitop se během další inkubace (20 min) připojí druhá monoklonální protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině kalcitoninu. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 1 – 2000 ng/l (při vyšších hodnotách se sérum ředí diluentem 100x). Analytická citlivost je 1 ng/l, funkční citlivost 3 ng/l. Preciznost v sérii 1 – 8 %, mezi sériemi 3 – 13 %; zpětný výtěžek 88 – 112 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 500000 ng/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (2 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší.

Další jednostupňovou variantou CLIA je vytvoření FITC – anti-FITC (fluorescein izotiokyanát) můstku. K jednomu epitopu kalcitoninu se připojí protilátka vůči CT značená FITC a k druhému epitopu kalcitoninu pak protilátka vůči CT značená ABEI [N-(aminobutyl)-N-(etylizoluminol)]. Magnetické mikrokuličky jsou potažené ovčí protilátkou vůči FITC, takže se na ně naváže imunokomplex (inkubace 15 min, 37 °C). Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk (do 3 s). Intenzita signálu je přímo úměrná hladině kalcitoninu. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0 – 20000 ng/l. Analytická citlivost ≤ 25 ng/l. Preciznost v sérii ≤ 10 %, mezi sériemi ≤ 15 %; zpětný výtěžek 90 – 110 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 50000 ng/l. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

Metoda CLIA je založena na sendvičové imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. Kalcitonin se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku vůči kalcitoninu, imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Druhým epitopem se CT váže na polyklonální kozí protilátku vůči kalcitoninu, konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který se hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci kalcitoninu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je 2 – 2000 ng/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 25000 ng/l. Detekční limit metody: 2 ng/l (2 SD). Preciznost v sérii: 2,2 – 3,9 %, celková: 7,5 – 11,4 %. Zpětný výtěžek: 93 – 116 %, linearita ředění 85 – 120 %. Hemoglobin do 5,5 g/l, triacylglyceroly do 33,9 mmol/l a bilirubin do koncentrace 342µmol/l neinterferují. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému kalcitoninu a monoklonální myší protilátkou vůči lidskému kalcitoninu značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci kalcitoninu ve vzorku. Chylozita (22,6 mmol/l), hemolýza (2 g/l), ikterus (1128 µmol/l) a RF (< 1200 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,5 – 2000 ng/l (ředění 100x automaticky, ale koncentrace po ředění musí být > 20 ng/l. Detekční limit je 0,5 ng/l, funkční citlivost 1 ng/l. Preciznost v sérii CV 1,4 – 2,5 %, mezi sériemi 1,6 – 5,2 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 200000 ng/l.

HPLC se provádí na koloně oktydecylsilanizovaného oxidu křemičitého (velikost zrna 5 µm) 100x4,6 mm při 50 °C na mobilní fázi tetramethylamonium hydroxid-voda-acetonitril (s proměnlivým gradientem) při pH 2,5 (kyselina fosforečná) a fotometrickou detekcí 210 nm.

LC-MS/MS stanovuje kalcitonin v lidské plazmě v rozsahu 50 – 500000 ng/l. Po extrakci do acetonitrilu se vzorek centrifuguje. Extrakt se odpaří a odparek se rozpustí ve vodném roztoku guanidin hydrochloridu a provede se HPLC separace (kolona C18, mobilní fáze 1 % kyselina mravenčí ve vodě + 1 % kyselina mravenčí metanolu s gradientem. Doba separace je 2,5 min. Hmotnostní spektrometr používá elektrosprejovou ionizaci s monitorováním více reakcí (MRM). Sledují se rodičovský ion 859 (M + 4H⁺)⁴⁺ a produkt m/z 1107.

Mezinárodní standard: WHO International Standard Salmon Calcitonin NIBSC 98/586, Version 5.0, 03/03/2009.

Snížené hodnoty: cvičení, menopauza, pokročilý věk, somatotropin, EDTA; léky: antiepileptika, fenytoin.

Zvýšené hodnoty: kuřáci (i bývalí kuřáci), perniciosní anémie, alkoholická cirhóza, hyperplazie C-buněk štítné žlázy, feochromocytom, primární a sekundární hyperparatyreóza, nádory pankreatu, plic, prsu, štítné žlázy, pankreatitida, tyroiditida, chronické selhání ledvin, u novorozenců, v těhotenství (2. a 3. trimestr), požití alkoholu, laktace, po glukóze u obézních dětí; léky: adrenalin, estrogeny, glukagon, cholecystokinin, pentagastrin, perorální kontraceptiva.