EP, EPO, EPO-a, EPO-alpha, erythropoietin, erythropoetin, epoetin, erthropoyetin, hematopoietin, hemopoietin, MVCD2

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát sodný). Odběr mezi 7. a 12. h. Projevuje se diurnální variabilita s maximem uprostřed noci a minimem v ranních hodinách. Hemolýza, chylozita a bilirubin ruší. Stabilita při 20 – 25 °C 1 d, 4 – 8 °C 7 d, -20 °C 8 týdnů. Opakované rozmrazování se obvykle nedoporučuje.

RIA v kompetitivním uspořádání se dvěma protilátkami. Nejprve se do zkumavek dávkují standardy a vzorky, pak konjugát rekombinantního lidského erytropoetinu s ¹²⁵I a nakonec králičí protilátka vůči lidskému rekombinantnímu EPO. Kompetitivní imunoreakce se nechá probíhat buď 18 – 24 h při 20 – 25 °C. Pak se přidá precipitační kozí protilátka vůči králičímu IgG. Po protřepání (2 – 5 min) a centrifugaci (chlazená centrifuga) se supernatant odsaje nebo dekantuje a sraženina měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace EPO v kalibrátorech a vzorcích je nepřímo přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení sedmi sérových kalibrátorů a hodnoty EPO přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah stanovení je 3,3 – 200 U/l (vyšší koncentrace EPO se ředí nulovým kalibrátorem). Analytická citlivost je 3,3 U/l. Preciznost v sérii 5,2 – 9,4 %, mezi sériemi 6,2 – 11,0 %; linearita ředění je 96,6 – 125,2 %, zpětný výtěžek 88,8 – 107,1 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 200000 U/l.

ELISA je založena na sendvičovém principu, kdy se na monoklonální myší protilátku vůči lidskému EPO (vázanou na mikrotitrační destičce) naváže EPO ze vzorku a k jinému místu EPO se připojí biotinylovaná monoklonální myší protilátka vůči lidskému EPO (60 min inkubace, třepání). Po šestinásobném promytí se přidá konjugát streptavidinu s křenovou peroxidázou (15 min inkubace, třepání). Po šestinásobném promytí se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna reakce s peroxidázou (10 min ve tmě) se po zastavení stop činidlem (1 M H₃PO₄) sleduje fotometricky při 450/610-650 nm. Analýza probíhá při laboratorní teplotě. Mez detekce: 0,17 U/l. Rozsah měření je na základě sedmibodové kalibrace 0,17 – 100 U/l (vyšší koncentrace se ředí diluentem). Signál je přímo úměrný koncentraci EPO ve vzorku. Preciznost v sérii byla CV 1,7 – 5,3 %, mezi sériemi 0,9 – 10,9 %; zpětný výtěžek 84 – 114 %, linearita ředění 78 – 105 %.

Chemiluminiscenční stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. EPO se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce a druhým epitopem na monoklonální myší protilátku konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci EPO ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je 1 – 750 U/l. Vzorky s koncentrací EPO vyšší než 750 U/l se ředí univerzálním diluentem. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 100000 U/l. Detekční limit metody: 1,0 U/l (2 SD blanku), analytická citlivost: 0,5 U/l (blank), funkční citlivost 2,5 U/l (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii: 3,0 – 8,4 %, celková: 5,5 – 12,4 %. Zpětný výtěžek:  91 – 103 %, linearita ředění 84 – 122 %. Hemoglobin do koncentrace 5,97 g/l, triacylglyceroly do 33,9 mmol/l, bilirubin do 342 µmol/l neinterferují. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující EPO a paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému EPO. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se kuřecí protilátka vůči myšímu rekombinantnímu EPO značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství prolaktinu. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě čtyřparametrové logistické křivky a šestibodové kalibrace je 0,6 – 750 U/l. (10x nulovým kalibrátorem alespoň do 4500 U/l). Analytická citlivost 0,6 U/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 30000 U/l. Preciznost v sérii je 0,3 – 16,6 %, celková 3,2 – 8,7 %. Linearita ředění 73 – 100 %, zpětný výtěžek 93 – 116 %. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

Mimo výše uvedené metody se také uvádí možnost imunoprecipitace, bez bližší specifikace metody.

Mezinárodní standard nese označení: 3rd WHO International Standard for Erythropoietin, recombinant, for bioassay NIBSC code: 11/170 (30. 10. 2012).

Snížené hodnoty: vrozená absence erytropoetinu, nádory, chronický zánět, hladovění, hypopituitarismus, hypotyreóza, ztráta ledvinové tkáně, selhání ledvin, zvýšený hemoglobin nebo hematokrit, horečka, hemodialýza; léky: amfotericin B, inhibitory ACE (angiotensin converting enzyme), acetazolamid, cisplatina, enalapril, furosemid, teofylin, estrogeny.

Zvýšené hodnoty: v dětství, anémie, nádory produkující erytropoetin, polycystické ledviny, těhotenství, alkoholismus, krevní transfuze, cvičení, tkáňová hypoxie, hemoglobinopatie; léky: anabolika, ACTH, androgeny, angiotensin, epinefrin, daunorubicin, fenoterol, růstový hormon, TSH.