WT1, Wilms tumor, akutní myeloidní leukémie

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve či kostní dřeně odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita RNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je udávána do 24 hodin po odběru při teplotě 20-25 °C, materiál se nesmí zamrazovat!   

Vyšetření se provádí z RNA extrahované z buněk bílé krevní řady manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s guanidiniovou solí (Trizol) a extrakčními mikrokolonkami. RNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování RNA se používá proces reverzní transktipce a tvorba cDNA. 

Cíl vyšetření: vyšetření exprese WT1 genu u akutní myeloidní leukémie pro diagnostiku a sledování minimální residuální choroby.    

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 612469                      

CE-IVD soupravy jsou založené na real-time PCR pracující na principu hydrolyzačních sond. Jde o kvantifikační soupravy, které by měly být vybaveny kalibračními standardy a možností normalizace exprese fúzního genu k provozním (house-keeping) genům. Reagencie pro izolaci a reverzní transkripci mohou a nemusejí být součástí soupravy.

Vyšetření inverze a provozního genu se provádí ve dvou zkumavkách a v dubletu. Příslušné sondy jsou obě značeny na 5´- konci stejným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný cDNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce.  

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v RNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.