5279A>G

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve (2-5 ml) odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita DNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je obvykle 72 hodin při teplotě 20-25 °C, 7 dní při teplotě 4-8 °C a 3 měsíce při teplotě -20 °C. Většina CE-IVD souprav jiný materiál k vyšetření nepřipouští. Přesto lze vyšetření provádět za optimalizovaných podmínek také ze vzorku kostní dřeně, buněk bukální sliznice, vlasových kořínků a v dalších materiálech, kde se nacházejí jaderné buňky nebo z nich uvolněná DNA.

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z biologického materiálu manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami, vysolení DNA či fenol/chloroformové extrakci. DNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Cíl vyšetření: trombofilní mutace pro určení rizika venózní trombózy, frekvence mutace v evropské populaci pod 1%.

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 227400

Výrobci CE-IVD souprav využívají princip real-time PCR a analýzu teplotu tání. Soupravy jsou designovány pro současné vyšetření více typů trombofilních mutací v genech pro FV, FII a MTHFR.

Analýza teploty tání dvouřetězcové DNA: Vyšetření je založeno na amplifikaci krátkého fragmentu genu pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR) s automatickou detekcí fluorescenčního signálu. Dvě hybridizační sondy jsou konstruovány tak, aby nasedaly dovnitř tvořících se amplikonů (na stejný řetězec) při annealovací (nasedací, hybridizační) fázi PCR. Jelikož koncentrace templátu během PCR vzrůstá, roste díky značení sond i výsledná fluorescence. Pro vlastní analýzu přítomnosti mutace je používána následná fluorescenční analýza teploty tání dvouřetězce DNA vlákno/sonda (Tm). Při analýze Tm se využívá faktu, že hybridizační sondy při teplotách vyšších než je jejich Tm se od sebe vzdalují (denaturují) a výsledná fluorescence v kapiláře klesá. V případě přítomnosti mutace není při hybridizaci dosaženo úplné homologie mezi templátem a první sondou, což se v důsledku projeví snížením Tm a denaturací dvouřetězce amplikonu při nižší teplotě.

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými genotypy a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v DNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.