Kirsten ras, KiRAS, KRAS2, somatic mutations

K vyšetření je třeba řez tkáně zalité v parafinovém bločku nebo tkáň nativní.  

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z parafinového bločku po deparafinizaci. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami. DNA se po izolaci charakterizuje fluorimetricky nebo pomocí real-time PCR. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Cíl vyšetření: vyloučení mutace k predikci biologické léčby kolorektálních karcinomů na bázi monoklonálních protilátek proti EGFR.  

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 190070

Panel mutací pokrývá zejména kodony 12,13 a 61 v souladu se současnými doporučeními onkologických společností.    

Většina laboratoří preferuje vyšetření mutace pomocí automatizovaných metod, např. analýzou teploty tání, metodou alelické diskriminace, hybridizačními metodami, analýzou restrikčních fragmentů, alelově specifickou amplifikací, Sangerovým sekvenováním nebo sekvenováním nové generace (NGS). CE-IVD soupravy využívají zejména real-time PCR, hybridizační metody a NGS. 

Analýza teploty tání dvouřetězcové DNA: Vyšetření je založeno na amplifikaci krátkého fragmentu genu pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR) s automatickou detekcí fluorescenčního signálu. Dvě hybridizační sondy jsou konstruovány tak, aby nasedaly dovnitř tvořících se amplikonů (na stejný řetězec) při annealovací (nasedací, hybridizační) fázi PCR. Jelikož koncentrace templátu během PCR vzrůstá, roste díky značení sond i výsledná fluorescence. Pro vlastní analýzu přítomnosti mutace je používána následná fluorescenční analýza teploty tání dvouřetězce DNA vlákno/sonda (Tm). Při analýze Tm se využívá faktu, že hybridizační sondy při teplotách vyšších než je jejich Tm se od sebe vzdalují (denaturují) a výsledná fluorescence v kapiláře klesá. V případě přítomnosti mutace není při hybridizaci dosaženo úplné homologie mezi templátem a první sondou, což se v důsledku projeví snížením Tm a denaturací dvouřetězce amplikonu při nižší teplotě.

Metoda alelické diskriminace pomocí hydrolyzačních sond: Součástí reakční směsi pro real-time PCR jsou hybridizační sondy specifické ke zdravé (normální) a mutované alele. Pokud se vyšetření provádí v jedné zkumavce, jsou obě značeny na 5´- konci odlišným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný DNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce. Jelikož obě sondy jsou vybaveny fluorofory o jiných emisních maximech, lze na základě výsledné emise určit genotyp vyšetřovaného jedince podle vlnových délek fotonů zachycených na detektoru. 

Reverzní hybridizace: Před PCR je jeden z primerů na 5´- konci označen biotinem. Po amplifikaci je amplikon denaturován a přidán v roztoku k nitrocelulózové membráně (nejčastěji tvaru úzkého proužku o rozměrech několika centimetrů), na kterou byly výrobcem ukotveny jednořetězcové neznačené sondy jak pro zdravou sekvenci, tak pro vyšetřovanou mutaci. Při následné inkubaci dochází k hybridizaci a vyvázání DNA z roztoku na membránu. Po vymytí nespotřebované DNA je přidán komplex streptavidinu s enzymem (alkalická fosfatáza nebo peroxidáza). Při inkubaci se  na membráně ve specifických místech vytvoří "sendvič", který je složen z neznačené sondy, jednořetězce amplikonu s biotinem a s ním vázaný streptavidinový komplex s enzymem. Po vymytí nespotřebovaných reagencií se v poslední fázi přidává bezbarvý chromogen a reakcí s enzymem v přesně daném místě membrány dojde ke vzniku zbarvení. Membrána se nakonec opláchne demineralizovanou vodou a nechá vysušit. Proces může být manuální nebo automatický s dilutory, scannerem k hodnocením výsledku a možností přenosu obrázku a získaných dat do počítače.

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými typy mutací a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

Nebyly popsány, zásadní je stupeň degradace DNA působením fixativa (formaldehyd).