fosfatidylinositol 3-kináza, PI3K, somatic mutations

K vyšetření je třeba řez tkáně zalité v parafinovém bločku nebo tkáň nativní.  

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z parafinového bločku po deparafinizaci. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami. DNA se po izolaci charakterizuje fluorimetricky nebo pomocí real-time PCR. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Cíl vyšetření: vyloučení mutace k predikci biologické léčby nádorů (nádory GIT, mozku, plic, endometria, vaječníků, prsní žlázy).  

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 171834

Většina laboratoří preferuje vyšetření mutace pomocí automatizovaných metod, CE-IVD soupravy využívají zejména real-time PCR, hybridizační metody a NGS. 

Analýza teploty tání dvouřetězcové DNA: Vyšetření je založeno na amplifikaci krátkého fragmentu genu pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR) s automatickou detekcí fluorescenčního signálu. Dvě hybridizační sondy jsou konstruovány tak, aby nasedaly dovnitř tvořících se amplikonů (na stejný řetězec) při annealovací (nasedací, hybridizační) fázi PCR. Jelikož koncentrace templátu během PCR vzrůstá, roste díky značení sond i výsledná fluorescence. Pro vlastní analýzu přítomnosti mutace je používána následná fluorescenční analýza teploty tání dvouřetězce DNA vlákno/sonda (Tm). Při analýze Tm se využívá faktu, že hybridizační sondy při teplotách vyšších než je jejich Tm se od sebe vzdalují (denaturují) a výsledná fluorescence v kapiláře klesá. V případě přítomnosti mutace není při hybridizaci dosaženo úplné homologie mezi templátem a první sondou, což se v důsledku projeví snížením Tm a denaturací dvouřetězce amplikonu při nižší teplotě.

Metoda alelické diskriminace pomocí hydrolyzačních sond: Součástí reakční směsi pro real-time PCR jsou hybridizační sondy specifické ke zdravé (normální) a mutované alele. Pokud se vyšetření provádí v jedné zkumavce, jsou obě značeny na 5´- konci odlišným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný DNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce. Jelikož obě sondy jsou vybaveny fluorofory o jiných emisních maximech, lze na základě výsledné emise určit genotyp vyšetřovaného jedince podle vlnových délek fotonů zachycených na detektoru. 

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými typy mutací a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

Nebyly popsány, zásadní je stupeň degradace DNA působením fixativa (formaldehyd).