Popis vyšetření: Genotypizace apolipoproteinu E

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

Apolipoprotein E, Apo E, E2/E3/E4 genotypizace 

Preanalytická fáze:

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve (2-5 ml) odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita DNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je obvykle 72 hodin při teplotě 20-25 °C, 7 dní při teplotě 4-8 °C a 3 měsíce při teplotě -20 °C. Většina CE-IVD souprav jiný materiál k vyšetření nepřipouští. Přesto lze vyšetření provádět za optimalizovaných podmínek také ze vzorku kostní dřeně, buněk bukální sliznice, vlasových kořínků a v dalších materiálech, kde se nacházejí jaderné buňky nebo z nich uvolněná DNA.

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z biologického materiálu manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami, vysolení DNA či fenol/chloroformové extrakci. DNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

 

Poznámky k analytické metodě:

Cíl vyšetření: Určení přítomnosti alel apoE2, apoE3 a apoE4 a z nich vyplývajících genotypů může být významné při hledání příčin zvýšené koncentrace cholesterolu v krvi. Byly popsány asociace mezi alelou apoE4 a vyšší hladinou LDL cholesterolu, výskytem aterosklerózy, infarktu myokardu a neurodegenerativních chorob u části populace.  

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 107741                       

Jelikož se jedná o vesměs frekventované vyšetření, většina laboratoří preferuje vyšetření mutace pomocí automatizovaných metod, např. metodou alelické diskriminace, hybridizačními metodami, analýzou restrikčních fragmentů, alelově specifickou amplifikací nebo přímým sekvenováním. CE-IVD soupravy využívají zejména metody reverzní hybridizace, metody alelické diskriminace a analýzu restrikčních fragmentů. 

Metoda alelické diskriminace pomocí hydrolyzačních sond: Součástí reakční směsi pro real-time PCR jsou hybridizační sondy specifické ke zdravé (normální) a mutované alele. Pokud se vyšetření provádí v jedné zkumavce, jsou obě značeny na 5´- konci odlišným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný DNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce. Jelikož obě sondy jsou vybaveny fluorofory o jiných emisních maximech, lze na základě výsledné emise určit genotyp vyšetřovaného jedince podle vlnových délek fotonů zachycených na detektoru.

Reverzní hybridizace: Před PCR je jeden z primerů na 5´- konci označen biotinem. Po amplifikaci je amplikon denaturován a přidán v roztoku k nitrocelulózové membráně (nejčastěji tvaru úzkého proužku o rozměrech několika centimetrů), na kterou byly výrobcem ukotveny jednořetězcové neznačené sondy jak pro zdravou sekvenci, tak pro vyšetřovanou mutaci. Při následné inkubaci dochází k hybridizaci a vyvázání DNA z roztoku na membránu. Po vymytí nespotřebované DNA je přidán komplex streptavidinu s enzymem (alkalická fosfatáza nebo peroxidáza). Při inkubaci se  na membráně ve specifických místech vytvoří "sendvič", který je složen z neznačené sondy, jednořetězce amplikonu s biotinem a s ním vázaný streptavidinový komplex s enzymem. Po vymytí nespotřebovaných reagencií se v poslední fázi přidává bezbarvý chromogen a reakcí s enzymem v přesně daném místě membrány dojde ke vzniku zbarvení. Membrána se nakonec opláchne demineralizovanou vodou a nechá vysušít. Proces může být manuální nebo automatický s dilutory, scannerem k hodnocením výsledku a možností přenosu obrázku a získaných dat do počítače.

Analýza restrikčních fragmentů: PCR produkt v oblasti pokrývající kodony 112 a 158 genu je po amplifikaci štěpen restrikčním enzymem. Vyšetření restrikčních fragmetů se provádí na horizontální nebo vertikální elektroforéze. 

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými genotypy a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

Související vyšetření:

Familiární defekt v genu apoB-100

 

Významné interference:

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v DNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.