Popis vyšetření: Mutace G20210A v genu pro faktor II

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

Protrombinový gen

Preanalytická fáze:

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve (2-5 ml) odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita DNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je obvykle 72 hodin při teplotě 20-25 °C, 7 dní při teplotě 4-8 °C a 3 měsíce při teplotě -20 °C. Většina CE-IVD souprav jiný materiál k vyšetření nepřipouští. Přesto lze vyšetření provádět za optimalizovaných podmínek také ze vzorku kostní dřeně, buněk bukální sliznice, vlasových kořínků a v dalších materiálech, kde se nacházejí jaderné buňky nebo z nich uvolněná DNA.

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z biologického materiálu manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami, vysolení DNA či fenol/chloroformové extrakci. DNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Poznámky k analytické metodě:

Cíl vyšetření: trombofilní mutace pro určení rizika venózní trombózy.

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 176930

Jelikož se jedná o vesměs frekventované vyšetření, většina laboratoří preferuje vyšetření mutace pomocí automatizovaných metod, např. analýzou teploty tání, metodou alelické diskriminace, hybridizačními metodami, analýzou restrikčních fragmentů, alelově specifickou amplifikací nebo přímým sekvenováním. CE-IVD soupravy využívají zejména první tři zmíněné principy vyšetření.

Analýza teploty tání dvouřetězcové DNA: Vyšetření je založeno na amplifikaci krátkého fragmentu genu pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR) s automatickou detekcí fluorescenčního signálu. Dvě hybridizační sondy jsou konstruovány tak, aby nasedaly dovnitř tvořících se amplikonů (na stejný řetězec) při annealovací (nasedací, hybridizační) fázi PCR. Jelikož koncentrace templátu během PCR vzrůstá, roste díky značení sond i výsledná fluorescence. Pro vlastní analýzu přítomnosti mutace je používána následná fluorescenční analýza teploty tání dvouřetězce DNA vlákno/sonda (Tm). Při analýze Tm se využívá faktu, že hybridizační sondy při teplotách vyšších než je jejich Tm se od sebe vzdalují (denaturují) a výsledná fluorescence v kapiláře klesá. V případě přítomnosti mutace není při hybridizaci dosaženo úplné homologie mezi templátem a první sondou, což se v důsledku projeví snížením Tm a denaturací dvouřetězce amplikonu při nižší teplotě. 

Metoda alelické diskriminace pomocí hydrolyzačních sond: Součástí reakční směsi pro real-time PCR jsou hybridizační sondy specifické ke zdravé (normální) a mutované alele. Pokud se vyšetření provádí v jedné zkumavce, jsou obě značeny na 5´- konci odlišným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný DNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce. Jelikož obě sondy jsou vybaveny fluorofory o jiných emisních maximech, lze na základě výsledné emise určit genotyp vyšetřovaného jedince podle vlnových délek fotonů zachycených na detektoru.  

Reverzní hybridizace: Před PCR je jeden z primerů na 5´- konci označen biotinem. Po amplifikaci je amplikon denaturován a přidán v roztoku k nitrocelulózové membráně (nejčastěji tvaru úzkého proužku o rozměrech několika centimetrů), na kterou byly výrobcem ukotveny jednořetězcové neznačené sondy jak pro zdravou sekvenci, tak pro vyšetřovanou mutaci. Při následné inkubaci dochází k hybridizaci a vyvázání DNA z roztoku na membránu. Po vymytí nespotřebované DNA je přidán komplex streptavidinu s enzymem (alkalická fosfatáza nebo peroxidáza). Při inkubaci se  na membráně ve specifických místech vytvoří "sendvič", který je složen z neznačené sondy, jednořetězce amplikonu s biotinem a s ním vázaný streptavidinový komplex s enzymem. Po vymytí nespotřebovaných reagencií se v poslední fázi přidává bezbarvý chromogen a reakcí s enzymem v přesně daném místě membrány dojde ke vzniku zbarvení. Membrána se nakonec opláchne demineralizovanou vodou a nechá vysušít. Proces může být manuální nebo automatický s dilutory, scannerem k hodnocením výsledku a možností přenosu obrázku a získaných dat do počítače.

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými genotypy a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

 Související vyšetření:

Vyšetření Leidenské mutace (G1691A) v genu pro FV

Vyšetření mutace C677T v genu pro MTHFR

Vyšetření mutace A1298C v genu pro MTHFR

 

Významné interference:

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v DNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.