Popis vyšetření: Typizace alel HLA systému

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

lokusy A, B, C, DRB1, DQB1, DQA1, DPB1, DRB3/4/5.

Preanalytická fáze:

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve (2-5 ml) odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita DNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je obvykle 72 hodin při teplotě 20-25 °C, 7 dní při teplotě 4-8 °C a 3 měsíce při teplotě -20 °C. 

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z biologického materiálu manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami, vysolení DNA či fenol/chloroformové extrakci. DNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Poznámky k analytické metodě:

Cíl vyšetření: určení genotypu alel HLA systému pro lokusy A, B, C, DRB1, DQB1, DQA1, DPB1, DRB3/4/5. 

Většina laboratoří preferuje vyšetření mutace pomocí automatizovaných metod, např. analýzou teploty tání, metodou alelické diskriminace, hybridizačními metodami, analýzou restrikčních fragmentů, alelově specifickou amplifikací, Sangerovým sekvenováním nebo sekvenováním nové generace (NGS). CE-IVD soupravy využívají zejména hybridizační metody. 

Reverzní hybridizace: Před PCR je jeden z primerů na 5´- konci označen biotinem. Po amplifikaci je amplikon denaturován a přidán v roztoku k nitrocelulózové membráně (nejčastěji tvaru úzkého proužku o rozměrech několika centimetrů), na kterou byly výrobcem ukotveny jednořetězcové neznačené sondy jak pro zdravou sekvenci, tak pro vyšetřovanou mutaci. Při následné inkubaci dochází k hybridizaci a vyvázání DNA z roztoku na membránu. Po vymytí nespotřebované DNA je přidán komplex streptavidinu s enzymem (alkalická fosfatáza nebo peroxidáza). Při inkubaci se  na membráně ve specifických místech vytvoří "sendvič", který je složen z neznačené sondy, jednořetězce amplikonu s biotinem a s ním vázaný streptavidinový komplex s enzymem. Po vymytí nespotřebovaných reagencií se v poslední fázi přidává bezbarvý chromogen a reakcí s enzymem v přesně daném místě membrány dojde ke vzniku zbarvení. Membrána se nakonec opláchne demineralizovanou vodou a nechá vysušit. Proces může být manuální nebo automatický s dilutory, scannerem k hodnocením výsledku a možností přenosu obrázku a získaných dat do počítače.

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými genotypy a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

 

 

 

Významné interference:

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v DNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.