Popis vyšetření: Vyšetření krevních skupin AB0

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

ABO HISTO-BLOOD GROUP GLYCOSYLTRANSFERASES, A a B transferasy

Preanalytická fáze:

K vyšetření je třeba vzorek venózní krve (2-5 ml) odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita DNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je obvykle 72 hodin při teplotě 20-25 °C, 7 dní při teplotě 4-8 °C a 3 měsíce při teplotě -20 °C. 

Vyšetření se provádí z DNA extrahované z biologického materiálu manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s extrakčními mikrokolonkami, vysolení DNA či fenol/chloroformové extrakci. DNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování DNA se používá zamrazení vzorku DNA.

Poznámky k analytické metodě:

Cíl vyšetření: určení genotypu v systému AB0 (9q34, 7 exonů, alely AB0*A101, *A201, *B101, *O01, *O03 a další) u novorozenců s transfúzí erytrocytů od jiné osoby, pro forenzní účely nebo monitorování stavu po alogenní transplantaci kostní dřeně. 

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 110300

U CE-IVD souprav je často využíván přístup alelově specifické amplifikace nebo reverzně hybridizační.

Alelově specifické amplifikační metody využívají specifity jednoho z použitých primerů na jeho 3´- konci, která umožňuje amplifikaci populačně běžné alely (wild-type) nebo méně zastoupené alelické varianty, jejíž přítomnost podmiňuje příznaky coeliakie. Pro každý vyšetřovaný vzorek jsou tak k dispozici reakční mixy specifické pro danou alelu (zpravidla 2). Hodnocení proběhlé amplifikace se provádí pomocí horizontální nebo vertikální elektroforézy. Lze tak určit nejen přítomnost určitého typu alely, ale i genotyp osoby pro sledovaný lokus DNA.

Reverzní hybridizace: Před PCR je jeden z primerů na 5´- konci označen biotinem. Po amplifikaci je amplikon denaturován a přidán v roztoku k nitrocelulózové membráně (nejčastěji tvaru úzkého proužku o rozměrech několika centimetrů), na kterou byly výrobcem ukotveny jednořetězcové neznačené sondy jak pro zdravou sekvenci, tak pro vyšetřovanou mutaci. Při následné inkubaci dochází k hybridizaci a vyvázání DNA z roztoku na membránu. Po vymytí nespotřebované DNA je přidán komplex streptavidinu s enzymem (alkalická fosfatáza nebo peroxidáza). Při inkubaci se  na membráně ve specifických místech vytvoří "sendvič", který je složen z neznačené sondy, jednořetězce amplikonu s biotinem a s ním vázaný streptavidinový komplex s enzymem. Po vymytí nespotřebovaných reagencií se v poslední fázi přidává bezbarvý chromogen a reakcí s enzymem v přesně daném místě membrány dojde ke vzniku zbarvení. Membrána se nakonec opláchne demineralizovanou vodou a nechá vysušít. Proces může být manuální nebo automatický s dilutory, scannerem k hodnocením výsledku a možností přenosu obrázku a získaných dat do počítače.

CE-IVD souprava by vždy měla obsahovat kontrolní vzorky se známým genotypem. Ideální jsou soupravy obsahující kontroly s různými genotypy a kontrolu bez DNA templátu (demineralizovanou vodu).

 

 

 

Významné interference:

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v DNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.