akutní promyelocytární leukémie, PML-retinoic acid receptor-alpha, t(15;17)(q22;q11.2-q12) translocation, AML M3

K vyšetření je třeba vzorek kostní dřeně ze sterna a venózní krve odebrané do vakuované plastové zkumavky s EDTA. Stabilita RNA v biologickém materiálu pro toto vyšetření je udávána do 24 hodin po odběru při teplotě 20-25 °C, materiál se nesmí zamrazovat!   

Vyšetření se provádí z RNA extrahované z buněk bílé krevní řady manuálními nebo automatizovanými postupy. Nejčastěji jsou založené na práci s guanidiniovou solí (Trizol) a extrakčními mikrokolonkami. RNA se po izolaci charakterizuje spektrofotometricky, fluorimetricky nebo elektroforeticky. Pro dlouhodobější (déle než týdenní) uchování RNA se používá proces reverzní transktipce a tvorba cDNA. 

Cíl vyšetření: potvrzení translokace chromosomů 15 a 17, důsledkem je fúzní gen PML-RARA typ bcr1 (zlom v intronu 6 genu PML) nebo typ bcr2 (zlom v exonu 6 genu PML) či typ bcr3 (zlom v intronu 3 genu PML) pro diagnostiku a sledování minimální residuální choroby u akultní promyelocytární leukémie s potvrzeným typem translokace.  

Přístup z OMIM katalogu (Online Mendelian Inheritance in Man): 102578

CE-IVD soupravy jsou založené na real-time PCR pracující na principu hydrolyzačních sond. Jde o kvantifikační soupravy, které by měly být vybaveny kalibračními standardy a možností normalizace exprese fúzního genu k provozním (house-keeping) genům. Reagencie pro izolaci a reverzní transkripci mohou a nemusejí být součástí soupravy.

Vyšetření fúzního a provozního genu se provádí ve dvou zkumavkách. Příslušné sondy jsou obě značeny na 5´- konci stejným fluoroforem (např. FAM a JOE). Na 3´ konci sond je umístěn tzv. zhášeč (quencher). Při PCR je sonda hybridizována na příslušný cDNA templát na základě komplementarity a poté hydrolyzována exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Uvolněný fluorofor příslušného typu lze detekovat jako fluorescenční záření o specifické vlnové délce. 

Některé CE-IVD soupravy pro identifikační účely využívají principu dvoustupňové PCR reakce (tzv. nested PCR) s elektroforetickou koncovkou. Výhodou je velká citlivost, nevýhodou pracnost, časová náročnost, riziko kontaminace PCR produktem a nemožnost kvantifikace. 

Popisovány jsou interference heparinu použitého jako antikoagulační činidlo, hemu při hemolytickém vzorku, residua organických rozpouštědel a solí v RNA extraktech, extrémně vysokých koncentrací dvojmocných kationtů. Výsledky nelze uzavřít v případě falešné negativity a falešné pozitivity výsledku PCR. Vyšetření nelze často provést z krve při aplastické anémii, imunosupresi před transplantací kostní dřeně, apod.